近日，《Nature》报道“RNA N-glycosylation enables immune evasion and homeostatic efferocytosis”的研究论文，为我们揭示了这个谜题的答案。研究发现N-糖链能够阻止先天免疫系统对内源小RNA的识别。该研究揭示了N-糖链通过隐藏acp3U，使glycoRNA在细胞表面和内体网络中存在而不引发自身炎性反应，为理解RNA修饰与免疫调控提供新视角。接下来，让我们深入解析这篇《Nature》文章的核心内容，一探N-糖基化RNA如何精细调控免疫反应，防止免疫系统的过度激活。

为探究RNA N-糖基化是否决定自身与非自身核酸的免疫感知，研究者从HeLa细胞中分离小RNA（富含唾液酸糖基化 RNA）并分别用切除N-糖链的酶（PNGase F）和RNA酶（RNase）单独及联合处理。酶切后，将这些RNA转入RAW巨噬细胞，检测干扰素-β（IFNβ）的产生（图S1A）。结果显示，与对照组相比，经PNGase F去N-糖基化的小RNA强烈诱导IFNβ产生。若将PNGase F处理的小RNA预先用RNase处理则无IFNβ产生，表明干扰素反应由完整但去N-糖基化的RNA引起（图1a）。此外，去N-糖基化的小RNA在未转染的情况下添加到RAW巨噬细胞中也能诱导IFNβ表达（图S1B）。相比之下，PNGase F处理对不含糖基化RNA的长RNA无免疫刺激活性（图1b），对合成RNA poly(I:C)诱导的IFNβ产生也无影响（图1c），说明小RNA去N-糖基化是I型干扰素的强诱导因素。

研究者进一步检测了I型干扰素产生的PRR信号关键组分——ANK结合激酶1（TBK1）和干扰素调节因子3（IRF3）的激活情况。结果显示，仅在转入PNGase F处理的小RNA的细胞中观察到TBK1和IRF3的磷酸化（图1d）。此外，PNGase F处理的小RNA刺激RAW巨噬细胞中JNK、ERK1/2、p38以及NF-κB p65的激活（图1e）。此外，去N-糖基化的RNA还诱导myddosome组装（图S1C）。去N-糖基化小RNA的免疫刺激效应不仅限于RAW巨噬细胞，还可在小鼠腹腔巨噬细胞以及人浆细胞样树突状细胞（pDCs）和巨噬细胞中诱导I型干扰素、肿瘤坏死因子（TNF）或白细胞介素-6（IL-6）产生（图1f，S1D、E），表明去N-糖基化的小RNA激活了先天免疫信号。

研究者推测，细胞表面糖基化RNA通常定位于含RNA传感器的内体中。故假设向细胞添加大量PNGase F可使细胞表面糖基化RNA去N-糖基化，直接刺激内体中的RNA传感器。实验向RAW巨噬细胞添加递增剂量的PNGase F（为之前处理分离小RNA样本用量的3、9和15倍）或PNGase F和RNase。结果显示，添加九倍用量则才可以诱导RNA依赖的先天免疫反应（图S1F）。这些研究数据表明糖基化RNA被其N-糖链屏蔽，从而逃避免疫系统的识别。

图1. N-糖链保护小RNA免受先天免疫系统的识别

图S1. N-糖链保护小RNA免受先天免疫系统的识别

为探究糖基化RNA在血液中的存在及其免疫刺激性，研究者从不同来源提取RNA并进行分析。研究者提取了小鼠和人类血液以及HeLa细胞（作为对照）中的RNA，并采用rPAL方法进行标记。结果显示，所有三种来源的RNA均呈现rPAL信号。进一步对比分析发现，与细胞来源的RNA相比，人和小鼠血清中的糖基化RNA与总RNA比例更高，且展现出不同的分子量带型（图1g和S2A、B）。在rPAL标记前定量为1 μg的RNA中，血清RNA每微克产生的rPAL信号强度是HeLa细胞RNA的38倍（图S2C-E）。

鉴于在循环系统中检测到糖基化RNA，研究者进一步研究其去N-糖基化后的免疫原性。实验发现，与未经处理的血清RNA相比，经PNGase F去N-糖基化的小鼠和人类血清RNA在小鼠腹腔巨噬细胞和人类THP1巨噬细胞中显著诱导IFNβ、TNF和IL-6 产生（图1h-k）。这些数据表明糖基化RNA存在于小鼠和人类的循环系统中，且其去N-糖基化可引发炎症反应。

图S2. 循环系统中存在GlycoRNAs

由于细胞表面暴露的RNA在细胞凋亡并被吞噬细胞吞噬时，可能会激活内体RNA受体。因此，研究者猜想RNA的N-糖基化可能阻止内体RNA受体的激活。为验证这一假设，研究者用doxorubicin诱导HeLa细胞凋亡，将活细胞和凋亡细胞用PNGase F处理以去除细胞表面分子的N-糖基化，然后在体外刺激腹腔巨噬细胞（图2a）。结果显示，经PNGase F处理的凋亡细胞可强烈诱导IFNβ产生，而经PNGase F+RNase处理的凋亡细胞诱导的几乎没有IFNβ产生（图2b），表明去N-糖基化凋亡细胞以RNA依赖的方式引发强烈的炎症反应。吞噬作用需要吞噬细胞内的细胞骨架重塑。研究者通过预先用肌动蛋白聚合抑制剂细胞松弛素D处理巨噬细胞，抑制凋亡细胞的吞噬作用，观察到经过去N-糖基化处理的凋亡细胞引发的天然免疫激活显著降低，表现为IFNβ产生减少（图2c）。这表明吞噬作用是去N-糖基化凋亡细胞诱导RNA驱动的I型干扰素反应的必要条件。

进一步研究发现，紫外线诱导凋亡的细胞经PNGase F去N-糖基化后也能以RNA依赖的方式强烈诱导IFNβ产生（图2d）。此外，研究者还观察到，去N-糖基化凋亡细胞的吞噬作用可诱导RAW巨噬细胞中IRF3的激活（图2e），以及THP1巨噬细胞和腹腔巨噬细胞中IL-6和TNF的产生（图2g, 3SC、D）。在体内实验中，向野生型小鼠腹腔注射经PNGase F处理的凋亡细胞后，可在腹腔灌洗液中检测到IFNβ（图2h）。这些数据表明，细胞表面RNA的N-糖基化有助于凋亡细胞的免疫清除。

图2. 细胞表面RNA的去糖基化使凋亡细胞具有免疫刺激作用

图S3. 细胞表面RNA的去糖基化使凋亡细胞具有免疫刺激作用

acp3U是唾液酸糖基化RNA上N-糖链的连接位点，由DTWD1和DTWD2合成。研究者发现，来自DTWD2敲除U2OS细胞的小RNA无法诱导IFNβ产生（图3a，S4A）。同样地，DTWD2敲除的凋亡细胞在被巨噬细胞吞噬时也无法诱导IFNβ产生（图3b，S4B）。进一步地，DTWD2敲除细胞来源的小RNA和凋亡细胞在去N-糖基化后也不能在THP1巨噬细胞中诱导RNA依赖的先天免疫反应（图S4C、D）。在体内实验中，DTWD2敲除的凋亡细胞（无论是否经过PNGase F处理）在腹腔注射后未能诱导IFNβ反应（图3c）。

根据以上内容，研究者推测，acp3U对于去N-糖基化RNA的免疫原性至关重要。PNGase F处理会去除整个N-糖链，暴露由DTWD2产生的acp3U。而来自DTWD2敲除细胞的小RNA因缺乏acp3U，失去了诱导IFNβ的能力。为了验证这一假设，研究者利用Endo-F2和Endo-F3酶处理小RNA，使acp3U被单个葡萄糖胺（GlcNAc）阻断。结果显示，经Endo-F2+F3处理的小RNA在转染到RAW或腹腔巨噬细胞后未能诱导IFNβ产生（图S4E），并且经Endo-F2+F3处理的凋亡细胞在吞噬过程中也不能刺激IFNβ产生（图S4F）。这些数据表明，RNA中暴露的acp3U能够强烈诱导对内源小RNA和凋亡细胞的先天免疫反应。

为了进一步确认acp3U的直接作用，研究者合成了含有未修饰尿苷或acp3U的18 bp的tRNA片段，并用其刺激THP1巨噬细胞。结果发现，含有acp3U的RNA相较于未修饰RNA能诱导更高水平的IL-6和TNF产生（图3d、e，S5A、B）。RNA-Seq分析显示，acp3U修饰的RNA诱导了与RNA感知和先天免疫反应相关的通路，尤其是干扰素信号通路（图3f、g，S5C-E）。这些发现表明，暴露的acp3U是RNA诱导先天免疫反应的关键因素。

图3. acp3U修饰的RNA可刺激先天免疫应答

图S4. acp3U修饰的RNA可刺激先天免疫应答

图S5. acp3U修饰的RNA可刺激先天免疫应答

为了进一步探究acp3U的免疫刺激作用，研究者合成了尿苷和acp3U单核苷，并用它们单独或联合刺激或转染THP1巨噬细胞和腹腔巨噬细胞。实验结果显示，当acp3U与尿苷联合使用时，IL-6、TNF和IFNβ的产生增加，这表明acp3U与未修饰的尿苷碱基结合时具有更强的免疫刺激性（图S6A-F）。研究者还从WT、MyD88敲除和TRIF敲除的小鼠中收集骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs），并用经PNGase F处理或未处理的小RNA刺激这些细胞。结果显示，PNGase F处理的小RNA在WT BMDMs中强烈诱导先天免疫反应（图4a）。然而，在敲除MyD88和敲除TRIF的BMDMs中，PNGase F处理的小RNA诱导的IFNβ产生显著降低，这表明TLR3和TLR7可能是小鼠识别去N-糖基化RNA的潜在受体。进一步研究结果表明，PNGase F处理的凋亡细胞诱导的IFNβ产生在敲除MyD88和敲除TRIF腹腔巨噬细胞中被消除。这些数据表明，MyD88和TRIF对去N-糖基化凋亡细胞的先天免疫激活是必需的（图4b）。

为了研究TLR3和TLR7在识别去N-糖基化RNA中的作用，研究者收集了来自WT、敲除TLR3和敲除TLR7小鼠的腹腔巨噬细胞和BMDMs，并用PNGase F处理或未处理的小RNA刺激这些细胞。发现与对照组相比，在敲除TLR3和敲除TLR7腹腔巨噬细胞和BMDMs中，去N-糖基化小RNA诱导的IFNβ产生降低，表明这两种受体对于识别去N-糖基化RNA是必需的（图4c、d）。进一步研究表明，敲除TLR3和敲除TLR7腹腔巨噬细胞的IFNβ产生被抑制（图4e），支持了TLR3和TLR7可以检测PNGase F处理的小RNA的假设。

为进一步探究TLR3和TLR7在感知acp3U RNA中的作用，研究者利用合成的56核苷酸长RNA（中央ssRNA环含有未修饰尿苷或acp3U，以及较长的dsRNA区域）刺激WT、敲除TLR3和敲除TLR7的腹腔巨噬细胞。结果显示，含acp3U的合成RNA可诱导IFNβ产生，而未修饰RNA的免疫刺激性较弱（图4f）。在TLR3和TLR7敲低的巨噬细胞中，acp3U-RNA诱导的IFNβ反应显著降低，且去N-糖基化小RNA和含acp3U的合成RNA可刺激人THP1巨噬细胞，但单核苷和合成acp3U-RNA电转导入细胞质未诱导IFNβ反应，表明acp3U-RNA的感知主要发生在外体中（图S7B、C）。研究者还在体内实验中向WT、敲除TLR3和敲除TLR7小鼠腹腔注射去N-糖基化凋亡细胞，发现IFNβ仅在WT小鼠腹腔灌洗液中产生（图4g）。这些数据表明TLR3和TLR7是去N-糖基化RNA的感受器，支持了N-糖基化通过化学屏蔽acp3U阻止其激活内体RNA传感器的模型（图4h）。

图4. TLR3和TLR7识别去N-糖基化RNA

图S6. acp3 U修饰的RNA刺激先天免疫应答

图S7. TLR3和TLR7识别去N-糖基化RNA

产品一：GlycoRNA-Seq

GlycoRNA-Seq是一项创新的测序技术，专门用于分析糖基化RNA(GlycoRNA)，这是一种在细胞表面发现的新型RNA修饰。云序生物能检测低丰度的GlycoRNA，提供全面、精细的GlycoRNA图谱；同时获取多类型的、带有特殊糖修饰的sncRNA。云序生物对测序数据进行精确的定量分析，比较不同样本间GlycoRNA表达水平的差异。

产品二：糖基化RNA质谱分析

为了明确糖基化RNA的糖链结构及修饰模式，云序生物推出糖基化RNA质谱分析。云序生物对GlycoRNA进行修饰质谱分析，从而得到除糖基化修饰之外的其他修饰类型，如acp3U、galQ等，助力研究其他RNA修饰与糖基化RNA的相互作用。

产品三：GlycoRNA qPCR

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