《Nat. Commun》重磅：云序m7G修饰 单细胞测序破译过敏性鼻炎加重新机制！

G3BP1蛋白是SGs形成的标志物，免疫荧光显示，OVA诱导的AR小鼠的鼻基底黏膜中存在G3BP1蛋白（图1a）。RNAscope检测结果表明，SGs主要在鼻黏膜的CD45+免疫细胞中组装（图1b）。免疫荧光进一步表明，SG主要在CD11b+髓系细胞中组装（图1c）。对从OVA诱导的AR小鼠鼻黏膜分选出的CD45+细胞进行scRNA-seq。共鉴定出12个细胞簇（图1d, e），其中巨噬细胞的G3bp1表达远高于中性粒细胞（图1f, g）。qRT-PCR和WB实验确定G3bp1主要在巨噬细胞（PMs和BMDMs）、AR小鼠中分离出的鼻黏膜巨噬细胞（NMM）、以及巨噬细胞系（RAW264.7和iBMDM）中表达（图1h, i, j）。

图1 在AR期间，SG在鼻粘膜的巨噬细胞中组装

两种AR小鼠模型（OVA和HDM）显示，巨噬细胞特异性G3bp1敲除（G3bp1^mac-/-）小鼠表现出减轻的AR症状（图2a）。中性粒细胞特异性G3bp1敲除（G3bp1^neu-/-）和嗜酸性粒细胞特异性G3bp1敲除（G3bp1^eos-/-）小鼠经OVA诱导的AR处理后表现出与对照组相似的AR症状。表明巨噬细胞而非中性粒细胞或嗜酸性粒细胞中的SG组装会加重AR。组织学染色表明巨噬细胞G3bp1缺失减轻了鼻黏膜上皮脱落、细胞浸润和渗出、以及粘液分泌（图2b, c）。流式细胞术分析结果显示，G3bp1^mac-/-小鼠的嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和T细胞浸润更低（图2d），鼻灌洗液（NLF）中的细胞浸润也更低（图2e），而与炎症消退相关的巨噬细胞的生成增加（图2f）。qRT-PCR与ELISA结果显示，G3bp1^mac-/-小鼠鼻黏膜中IL-4、IL-5、IL-13、IL-6、Prg2、Epx和Mpo和NLF中IL-4、IL-5和IL-13的表达均降低（图2g, h）。另外，G3bp1^mac-/-小鼠鼻黏膜和NMMs中IL-10的表达更高（图2g, i），G3bp1^mac-/-小鼠血清OVA特异性IgE浓度降低（图2j）。

图2 巨噬细胞SG组装促进AR进展

利用G3bp1^f/f和G3bp1^mac-/-小鼠的BMDMs进行mRNA-seq，鉴定出170个差异表达基因，KEGG和GSEA结果显示，G3BP1缺陷的巨噬细胞中内吞作用相关基因表达升高，内吞作用、蛋白质消化与吸收、ECM-受体相互作用和粘着斑等胞葬作用相关功能上调（图3a, b）。推测SG组装可能抑制巨噬细胞的胞葬能力并损害死亡免疫细胞的清除。

用两种刺激物（过敏原HDM或氧化应激诱导剂NaAsO₂）处理两类巨噬细胞（PMs和BMDMs），诱导SG形成后，将这些巨噬细胞分别与PKH26标记的三种不同凋亡免疫细胞（BMDEs、Jurkat细胞、BMNs）共培养，以检测巨噬细胞的吞噬功能。流式细胞术以及实时活细胞成像系统（Incucyte）分析结果表明，SG组装在体外抑制了巨噬细胞对凋亡免疫细胞的吞噬（图3c, d），带有SG的巨噬细胞几乎无法吞入正在凋亡的细胞（图3e）。HDM或NaAsO₂注入小鼠腹腔，腹腔渗出液中的巨噬细胞胞葬功能同样受到显著破坏（图3f）。此外，在G3bp1^mac-/-的BMDMs和NMMs中，SG组装后对PKH26标记的凋亡Jurkat和BMDE的吞噬作用被G3BP1缺失所阻断（图3g）。将PKH26标记的G3bp1^f/f巨噬细胞（红色）和PKH67标记的G3bp1^mac-/-巨噬细胞（绿色）与CellVue® Claret标记的凋亡Jurkat细胞（青色）共培养。无应激时，两种巨噬细胞均能吞噬Jurkat；但在应激条件下，红色（G3bp1f/f）巨噬细胞停止吞噬，而绿色（G3bp1^mac-/-）巨噬细胞仍能持续吞入Jurkat细胞（图3h, i）。在腹腔注射凋亡Jurkat与BMDE后，G3bp1^mac-/-小鼠的腹腔巨噬细胞（PM）摄取更多荧光标记的凋亡细胞（图 3j）。这些数据表明，巨噬细胞中的SG组装损害了胞葬作用。

图3 巨噬细胞中的SG组装损害胞葬作用

为探明SG抑制巨噬细胞胞葬的分子机制，从HDM刺激后的BMDM中纯化SG核心，mRNA-seq鉴定出203条颗粒富集转录本，定义为SG特异基因；在RAW264.7巨噬细胞中过表达Flag-G3BP1并进行RIP-seq，发现应激后G3BP1直接结合的转录本有291条且含GANGANGA共有基序；两组数据交叉比对最终锁定Lrp1、Dync1h1与Igf2r三个共有基因为潜在靶点（图4a）。

LRP1是巨噬细胞膜上识别凋亡细胞表面CALR与磷脂酰丝氨酸（PS）的关键胞葬受体；其mRNA在SG核心中富集度最高。RIP-qPCR证实，HDM刺激使G3BP1与Lrp1 mRNA结合增强，且结合依赖G3BP1保守的NTF2结构域（图4b, c）。RNA-scope、FISH及RNA pull down均显示应激下G3BP1与Lrp1 mRNA在SG内共定位（图4d, e）。免疫印迹和流式细胞术显示，HDM或NaAsO₂处理后巨噬细胞LRP1蛋白显著下调而mRNA不变（图4f, g），G3bp1缺失或敲低时则Lrp1蛋白升高、mRNA不变（图4 h-j）。

图4 巨噬细胞中的SG组装螯合Lrp1 mRNA以抑制其翻译

为探索应激颗粒（SG）下调LRP1蛋白的机制，在HDM刺激的巨噬细胞中进行多聚核糖体分析，发现SG组装显著抑制Lrp1 mRNA的翻译，而G3BP1的缺失能解除抑制（图5a、b）。m7G MeRIP-seq与m7G MeRIP-qPCR均证实Lrp1 mRNA内部存在大量N7-甲基鸟苷（m7G）修饰，且修饰序列特征与G3BP1结合序列吻合（图5c, d）。

据报道，Quaking蛋白7（QKI7）作为内部m7G阅读器，可将含有内部m7G修饰的转录本运输到SGs来调节它们在应激下的稳定性和翻译。免疫荧光和RNA-scope研究发现QKI7与SG核心蛋白G3BP1在HDM刺激的巨噬细胞SG中共定位，并将带内部m7G修饰的Lrp1 mRNA拖入颗粒（图5e, f）。RIP-qPCR和RNA pull down证实了QKI7与Lrp1 mRNA可直接结合，且该结合依赖QKI7保守的KH结构域（图5g, h, i）。HDM刺激后的多聚核糖体分析结果显示，QKI7过表达明显减少Lrp1 mRNA在多聚体的富集（图 5j）。

图5 内部经m7G修饰的Lrp1 mRNA被QKI7带入SG，从而抑制其翻译

为直接说明应激颗粒抑制LRP1表达在削弱巨噬细胞胞葬和促进AR中的作用，构建巨噬细胞特异性Lrp1敲除小鼠（Lrp1^mac-/-）。在OVA处理后，Lrp1^mac-/-鼠喷嚏和抓挠次数显著增加（图6a），鼻黏膜损伤加重、AR病理评分升高（图6b），嗜酸粒细胞、中性粒细胞和T细胞浸润增多（图6c），NLF中细胞因子水平均上升（图6d），血清OVA特异性IgE也升高。体内外巨噬细胞吞噬实验一致表明LRP1缺失导致巨噬细胞清除凋亡细胞受阻，从而加速AR进展（图6e–g）。

为验证SG诱导的AR是否依赖其对LRP1的抑制，杂交获得巨噬细胞特异性双敲除鼠G3bp1^mac-/-Lrp1^mac-/-。在OVA诱导的AR模型中，G3bp1^mac-/-Lrp1^mac-/-小鼠未能缓解症状，其喷嚏、抓挠次数（图6h）、鼻黏膜病理评分（图6i）、嗜酸粒细胞/中性粒细胞/T细胞浸润（图6j）、NLF中细胞因子水平以及血清OVA特异性IgE均与单敲Lrp1^mac-/-小鼠无差异。且G3bp1缺失也无法在体内恢复Lrp1缺失导致的巨噬细胞胞葬能力下降（图6k）。因此，当LRP1缺失时，G3BP1缺失或SG解聚均无法促进胞葬或减轻AR，表明SG通过抑制下游LRP1来削弱巨噬细胞胞葬并驱动AR进展。

图6 SG促进的AR依赖于胞葬作用受体LRP1的抑制作用

鉴于G3BP1通过NTF2结构域结合 Lrp1 mRNA（图4c），利用NTF2靶向抑制剂G3Ia阻断G3BP1-RNA共凝聚及SG形成。随后，在OVA诱导的AR模型中，每次OVA诱导前通过鼻子对Lrp1^f/f和Lrp1^mac-/-小鼠给予溶剂、SG诱导剂NaAsO₂或G3Ia，连续7天。结果显示，NaAsO₂组症状显著加重，而G3Ia组喷嚏、挠鼻次数明显减轻（图7a）。对AR患者鼻黏膜组织的免疫染色显示，与健康对照相比，而AR患者该部位巨噬细胞有SG发生（图7g），提示人AR发病过程中鼻黏膜巨噬细胞SG形成同样参与致病。

图7 用G3BP1特异性抑制剂阻止SG组装可减轻AR进展

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