云序生物助力单细胞测序 RNA修饰双剑合璧：破译生命密码！

作为免疫系统的关键组成部分，初始T细胞在抗原刺激下快速克隆扩增和分化，以执行有效的免疫应答。ac4C的writer蛋白NAT10可通过ac4C修饰调节维持mRNA稳定性，促进翻译。云序生物用户复旦大学医学院附属中山医院&金山医院武多娇团队研究揭示了NAT10介导的ac4C修饰在T细胞扩增和抗病毒免疫中的关键作用。

标题：A critical role of N4-acetylation of cytidine in mRNA by NAT10 in T cell expansion and antiviral immunity

发表期刊：Nature Immunology（IF=27.7）

发表时间：2025.3.5

发表单位：复旦大学医学院附属中山医院&金山医院

样品类型：脾脏、胸腺

详情可见往期公众号：云序用户Nat Immu IF 27.7|acRIP-seq，Ribo-seq，RNA-seq联合揭秘ac4C修饰调控网络

通过体外CD3/CD28处理和体内急性感染小鼠模型构建确定ac4C的writer蛋白NAT10在T细胞活化前后差异表达。

CD3/CD28处理6、24和48小时的T细胞中NAT10蛋白表达显著增加（图1a），并且T细胞活化后总RNA上的ac4C丰度增加（图1b）。用2×10⁵PFU感染野生型小鼠（图1c），感染后的血清分别提取RNA和分离CD3 T细胞用于WB。结果显示，LCMV在感染早期快速复制，在第8天基本消除（图1d）。NAT10蛋白表达的动态变化与病毒载量一致，表明与体外T细胞活化相似，T细胞中的NAT10也对体内活化和病毒清除产生反应（图1e）。

图1.NAT10 在T细胞活化过程中上调

1. 利用scRNA-seq确定NAT10的缺失干扰脾脏T细胞发育。

对6-8周龄NAT10-FLOX和NAT10-CKO小鼠的胸腺及脾脏细胞进行scRNA-seq，发现NAT10-CKO小鼠脾脏T细胞数量显著减少，而胸腺未受影响，表明NAT10的敲除主要干扰脾脏T细胞发育（图2）。

图2.NAT10敲除对脾脏及胸腺中细胞种类和数量的影响

2. 通过对NAT10-CKO的T细胞的多项细胞功能实验确定NAT10缺失导致T细胞增殖受损并增强细胞凋亡。

CellTrace稀释和CFSE体外标记结果表明，NAT10-CKO的T细胞细胞分裂标志减弱（图3a-c）。流式检测发现CKO T细胞颗粒度减小，细胞体积增长停滞（图3c）。BrdU/7-AAD双染显示CKO T细胞G0-G1期细胞比例升高（图3d）。而CKO小鼠的脾脏和淋巴结T细胞早期/晚期凋亡率均显著增加（图3e,f）。表明NAT10-CKO的T细胞增殖能力严重受损，T细胞数量显著减少。

图3.NAT10缺失对T细胞增殖与凋亡的双重影响

通过体外处理、acRIP-qPCR和RIP-qPCR确证NAT10直接靶向Myc mRNA。

CD3/CD28处理实验表明，MYC及其靶标在NAT10-CKO样本中的蛋白水平上显著降低（图4j）。acRIP-qPCR数据显示，ac4C峰广泛分布在Myc mRNA区域内，这些峰在Nat10缺失后均显著下调（图4k、l）。RIP-qPCR数据显示，NAT10蛋白可特异性结合Myc mRNA（图4n）。

图4.NAT10是Myc mRNA的稳定性和翻译效率所必需的

随着糖尿病发病率的逐年攀升和发病年龄的年轻化，胰岛β细胞发育成熟阶段的代谢表观调控成为胰岛领域研究的新热点，已有研究表明m6A RNA修饰影响胰岛素分泌和成熟β细胞的存活，但其如何调节胰腺发育和内分泌分化尚不清楚。云序客户上海交通大学医学院附属瑞金医院宁光院士、汪启迪教授团队揭示了Mettl3介导的m6A甲基化修饰调控胚胎胰腺双向潜能祖细胞命运和胰岛形成新机制。

标题：Mettl3-Mediated m6A Methylation Controls Pancreatic Bipotent Progenitor Fate and Islet Formation Free

发表期刊：Diabetes（IF=7.7）

发表时间：2023.11.14

发表单位：上海交通大学医学院附属瑞金医院

样品类型：胰腺细胞

详情可见往期公众号：云序客户| m6A MeRIP-seq助力揭示早发糖尿病表观调控新机制

引用文献：Wang Y, Sun J, Lin Z, et al. m6A mRNA methylation controls functional maturation in neonatal murine β-cells[J]. Diabetes, 2020, 69(8): 1708-1722.

研究团队前期利用mRNA-seq和m6A MeRIP-seq联合分析，证明Mettl3/14通过影响MafA mRNA稳定性来调节新生儿胰腺β细胞的功能成熟（图1），推测Mettl3介导的m6A甲基化可能调节胰腺发育（Wang et al., 2020）。

图1 Mettl3/14调节MafA表达以驱动β细胞功能成熟（Wang et al., 2020）

通过胰腺Mettl3特异性敲除小鼠（Mettl3-PKO）的表型鉴定确定Mettl3缺失导致早期糖尿病发病及胰岛形成障碍。

统计发现，在出生后8周内Mettl3-PKO体重与WT和杂合子没有差异（图2e）。然而，在出生时，Mettl3-Mettl3-PKO小鼠的随机血糖水平与WT和杂合子相当，而在2周龄时，Mettl3-Mettl3-PKO鼠随机血糖水平开始显著升高（图2f），血浆胰岛素水平降低（图2g）。此外，Mettl3-Mettl3-PKO小鼠出生时的胰腺重量和大小都显著降低（图2h-k）。

图2.Mettl3-PKO的表型鉴定

1. 利用scRNA-seq确定Mett13的缺失阻碍了双能祖细胞在E15.5晚期向内分泌祖细胞的转变。

研究团队对WT和Mettl3-PKO小鼠的胚胎胰腺细胞进行scRNA-seq，发现双能祖细胞群BP_late细胞作为内分泌祖细胞的前体，在Mettl3-PKO小鼠出现过量积累（图3）。表明Mett13的缺失阻碍了双能祖细胞在E15.5晚期向内分泌祖细胞的转变。

图3.Mett13敲除影响细胞分化

2. 利用m6A MeRIP-seq分析确定Mettl3缺失对胰腺细胞中m6A修饰的影响。

研究团队对WT和Mettl3-PKO的胰腺细胞进行m6A MeRIP-seq。相比WT组，Mettl3缺失的胰腺细胞中发现了1,241个高甲基化和6,543个低甲基化m6A峰，峰密度主要降低在Mettl3-PKO的编码序列区域（图4a-c）。进一步对甲基化转录本进行差异表达分析，发现Mettl3-PKO胰腺细胞中，有1,029个高甲基化转录本，3,985个低甲基化转录物本（图4e）。

3. scRNA-seq和m6A MeRIP-seq联合分析筛选下游靶基因。

联合m6A MeRIP-seq和Bp_late细胞中的scRNA-seq数据，确定了m6A修饰减少的70个下调转录本和43个上调转录本（图4g）。Hdac1是Wnt和Notch通路上游抑制因子，在Mettl3-PKO胰腺细胞中下调（图4h），并且其mRNAs在双能祖细胞中显著下调，但在内分泌祖细胞中的表达水平相当。

IGV可视化和MeRIP-qPCR结果显示，Mettl3-PKO中Hdac1mRNA上的m6A显著减少（图4h）。RIP-qPCR证明了Mettl3蛋白与Hdac1 mRNA互作（图4j）。ShMettl3慢病毒处理实验表明，Mettl3的缺失直接降低了E13.5胚胎胰芽中Hdac1 mRNA的稳定性（图4l）。此外，Hdac1免疫荧光染色也表明，Mettl3-PKO小鼠双能祖细胞的Hdac1荧光强度明显降低（图4m），Wnt信号通路的核心蛋白β-catenin和Notch信号通路的效应因子Hes1在胚胎胰腺细胞中的表达同时上调（图4n）。

图4.MeRIP-seq和scRNA-seq联合分析Hdac1是Mettl3介导的m6A修饰直接靶标。

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