云序助力丨北大魏文胜组登顶Nature Biotech (IF=42)：Ribo-seq揭示同义突变不沉默！

该研究使用PEmax系统和epegRNA进行有针对性的遗传编辑以生成不同类型的核苷酸取代的同义突变。PEmax通过慢病毒导入稳定整合到人类结肠癌（HCT 116）细胞系（该细胞系由于MLH1基因中存在天然纯合无义突变，便于PE编辑）中，并选择单个克隆用于后续研究。HCT 116-PEmax细胞的表达谱几乎与野生型（wild-type , WT）细胞的表达谱相同，并且感染非靶向或AAVS1（Adeno-Associated Virus Integration Site 1）靶向epegRNA的HCT 116-PEmax细胞（作为阴性对照）显示出最小的变化。这表明稳定的细胞系与WT HCT 116细胞系的特征非常相似。研究人员还评估了PEmax在HCT 116细胞中的编辑效率。在定期采样的28天培养期内，高效FANCF + 5 G-to-T突变的编辑在14天后显示出逐渐放缓的趋势，而低效RNF2 + 1 C-to-A突变的编辑效率随着时间的推移逐渐增加。鉴于表型变化往往落后于基因型变化，研究人员将筛查持续时间延长至35天，并将这种方法称为PRESENT（prime editor-based screen technology）（图 1a）。

图 1.高通量筛选揭示人类基因组中的功能性同义突变

为了进一步探索筛选结果与酵母研究结果之间的差异，研究人员检查了饱和同义突变在各种基因组中的分布：所有67个具有饱和同义突变设计的基因，HCT 116中的11个高度必需基因和酵母的12个人类同源基因。结果表明，虽然同义突变始终表现出中性效应，但非同义突变（错义、移码和无义突变）都对细胞适应度有明显影响（图 1g），与酵母中的结果不同。在饱和突变设计所针对的11个基因中，同义突变和错义突变之间存在显著的功能性差异（图 1h）。研究人员对其余10个基因进行了比较，Spearman相关性显示出了合理的一致性，尤其是对于高度必需的基因（图 1i）。虽然人类基因组中的同义突变主要是中性的，但研究中鉴定的409个富集突变证明了对细胞增殖的生物学影响。

为了阐明有害同义突变背后的机制，研究人员从基因、mRNA和核苷酸三个角度分析了它们。为探究其潜在机制，研究团队开发了机器学习模型DS Finder，并利用筛选数据将其训练为二元分类器（图 2a）。DS Finder超越了现有的两个模型：CADD（预测一般突变） 和 SilVA模型（针对同义突变）（图 2b）。

1. DS Finder 确定的关键特征包括密码子的第三个位置是 C-G 或 A-T 碱基对，其中 C-G 对更有可能影响细胞的适应性（扩展数据图 5i 和图 2c）。基因本质、表达水平和外显子 CpG 含量等因素也起着至关重要的作用（图 2c）。

2. 剪接的改变，尤其是剪接供体位点的缺失（图 2c），可能是驱动有害影响的主要机制（图 2d）。

3. 同义突变可通过改变密码子的使用和 mRNA 的折叠对细胞的适应性产生不利影响（图 2c,d）。

总之，DS Finder发现同义突变的有害影响是由多种因素共同驱动的，包括剪接破坏、密码子偏差和核苷酸保留等。

图2. 分析有害同义突变决定因素的机器学习模型

DS Finder发现剪接中断是同义突变产生有害影响的一个关键机制。结果发现，导致剪接供体缺失的突变占总数的12%，其次是产生新剪接供体的突变，占7%（图 3a,b）。研究人员开发了一种名为AbSplice的新模型来预测特定人体组织中由突变引起的异常剪接，利用AbSplice预测了可能导致结肠组织异常剪接的新突变，如PLK1_R136（AGG> AGA）和TSR2_Q88（CAG> CAA）（图 3c），结果发现近四分之一的同义突变可能导致异常剪接事件。研究选择了这些突变的一个子集进行验证，BUB1B_R322（AGG > AGA）突变位于 BUB1B 第 7 外显子和第 7 内含子的交界处（图 1e），是耗竭结果中排名第一的同义突变，它破坏了原来的剪接供体位点（供体缺失型），导致内含子保留（图 3d）。有趣的是，这种突变导致了两种异常的转录本变体：一种是第 7 内含子完全保留，另一种是在第 7 内含子中新建了一个剪接供体位点，导致内含子保留（图 3d）。由于过早地产生了终止密码子，这两种变体都可能导致 mRNA 降解。

研究进一步验证了这种突变对细胞适应度和 mRNA 丰度的影响（图 3e-g）。EEF2_G332 (GGC > GGT) 通过在外显子内产生一个新的剪接供体（供体增益型），这个新的剪接供体位于原来的供体之前，导致部分外显子切除和下游序列的移码（图 3h）。这种异常转录本会大大降低细胞的适应性和 mRNA 水平（图 3i-k）。这些发现表明，外显子-内含子边界附近的同义突变可诱导异常剪接，影响基因表达和细胞表型。

图3. 同义突变对异常RNA剪接的影响

除了异常的RNA剪接外，同义突变还影响细胞内的RNA折叠和翻译（图 2d）。在重要基因 PLK1 编码序列的早期发现了一个特定突变 PLK1_S2（AGT > AGC），该突变增强了 RNA 的稳定性（图 4a）。突变前后mRNA结构的预测分析显示，PLK1_S2 (AGT > AGC)突变增强了起始密码子附近局部mRNA结构的稳定性（图 4b，S5a-c）。研究人员进行了Western Blot分析测定PLK1蛋白水平，发现WT RTT对PLK1蛋白水平没有影响，而PLK1_S2（AGT > AGC）突变导致蛋白丰度下降（图 4c），观察到的细胞适应度下降完全归因于该单个同义突变（图 4d）。

考虑到突变诱导的茎结构破坏了WT PLK1 mRNA起始密码子附近的原始松散结构（图 4b），可能会阻碍翻译起始并带来翻译劣势，研究进一步使用核糖体印迹测序（Ribo-seq）评估该位点的翻译情况。结果表明，PLK1_S2（AGT > AGC）突变使得核糖体在起始密码子处的结合更具挑战性，但不影响转录水平（图 4e，扩展数据图 8b）。因此，启动翻译的困难导致蛋白质表达量减少。这种情况强调了同义突变诱导的RNA折叠变化及其对翻译过程的影响之间的关系，最终通过改变蛋白质水平影响细胞功能。

图4. 同义突变通过RNA折叠影响蛋白质翻译

为了系统性评估从筛选中发现的同义突变对高通量水平基因表达的影响，研究将单细胞筛选方法与PRESENT整合为DIRECTED-seq（直接epegRNA捕获和靶向测序）。研究人员同时捕获了单细胞的epegRNA和转录组（图 5a），还对同一批次的细胞进行了RNA-seq，以评估编辑效率（图 5a）。大多数 epegRNA 是有效的，在足够的测序深度下可检测到的突变的平均编辑效率约为15%（图 5b）。研究恢复了129193 个单细胞，平均每个细胞 5.5 个 epegRNA，每个目标同义突变在大约 1692 个细胞中都有体现（图 5c,d）。最终发现了40个显著影响基因表达的同义突变，假发现率（FDR）为10%（图 5e，表 S4）。一些同义突变（如BRCA1）可能会对细胞功能和肿瘤抑制机制产生重大影响（图 5f，表 S4）。DIRECTED-seq有效地将特定突变与基因表达的变化联系起来，揭示了其潜在的生物学影响。这些潜在影响凸显了进一步研究的必要性，以探索突变如何影响转录本丰富度及其更广泛的生物学影响。

图5. 基于DIRECTED-seq技术探究同义突变对基因表达的影响

研究系统性地探索了同义突变的致病机制与预测方法，使用了在筛选数据基础上训练的DS Finder，在临床数据库识别潜在致病的新型功能性突变（图 6a）。其中，G6PC3 c.G399A此前被注释为“可能良性”，但在该研究中却获得了最高的DS Finder评分，并得到了SilVA和CADD的支持（图 6b，表 S6）。该突变破坏了 RNA 剪接，损害了基因的正常功能，其方式与疾病机制一致（图 6c）。为了验证同义突变的致病性，研究人员在 HCT116 细胞中检测了 G6PC3 c.G399A，发现该突变产生了错误的转录本（图 6d），并显著降低了 G6PC3 的表达（图 6e）。DS Finder能够有效区分不同类别的突变（图 6f），证明了该模型的灵敏度。该研究还开发了"Hearing Silence"开放平台，提供免费使用的DS Finder算法。这项研究强调了探索人类基因组内其他功能性同义突变的潜力，这对理解疾病病因和深入研究其分子遗传机制至关重要

图6. 临床数据库中有害同义突变的预测研究

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