颠覆认知！外泌体惊现「糖RNA」《Nature Cell Biology》重磅揭示细胞通讯新密码

为了鉴定人体细胞中的糖基化RNA，研究团队设计出利用代谢标记技术联合经过应变促进的叠氮-炔烃环加成反应（SPAAC）表征糖修饰RNA的实验方案。利用三种不同的叠氮基糖类似物N-叠氮乙酰半乳糖胺-四酰基化（Ac4GalNAz）、N-叠氮乙酰甘露糖胺-四酰基化（Ac4ManNAz）和N-叠氮乙酰氨基葡萄糖-四酰基化（Ac4GlcNAz）作为代谢标记物，标记糖基化RNA（glycoRNA）。利用SPAAC结合生物素部分，所得的生物素共轭RNA（glycoRNA）在琼脂糖凝胶上溶解，并转移到硝化纤维素膜上。最后通过近红外IRDye 800CW链亲和素对glycoRNA进行可视化（图1a）。琼脂糖凝胶电泳结果表明，以Ac4GalNAz标记的糖修饰发生在较小的RNA中（图1b）。通过基于大小的RNA沉淀和硅胶柱层析法进一步确认，glycoRNA主要与小RNA群体（<200 nt）共迁移（图 1c）。此外，对RNA进行核酸酶处理，发现glycoRNA对RNase I敏感，对RNase A不敏感，对DNase Ⅰ具有抗性（图1d）。由于SpRai1能在去除UDP-GlcNAc后保持RNA完整，用SpRai1处理确定在RNA上检测到的叠氮化物是否由5'端帽构成，结果如图1e，红外IR-800信号强度几乎没有发生改变，这意味着糖修饰存在于RNA内部。

为揭示RNA糖基修饰在细胞生理学中的作用，研究团队首先评估了glycoRNA的胞内定位。将细胞核与总胞质组分分离后，进一步将胞质组分细分为可溶性胞质区室和膜性细胞器（质膜、内质网和高尔基体）。结果显示，glycoRNAs主要存在于膜性细胞器中（图2a,b）。微球菌核酸酶处理结果表明，Ac4GalNAz衍生的糖基化RNA并不位于细胞表面。为了直接验证糖基化RNA的具体定位，利用PureExo分离试剂盒纯化110nm内的纯外泌体，并分别利用Western blot和超分辨率随机光学重构显微镜（STORM）技术证实了外泌体的成功分离（图2c，d）。SPAAC分析表明，Ac4GalNAz衍生的糖基化RNA几乎完全存在于外泌体中，并且被包裹在外泌体腔内，而不是外泌体表面（图2c）。

研究团队利用纳米孔测序鉴定对外泌体glycoRNA的类型。通过SPAAC纯化出Ac4GalNAz标记的生物素化RNA，利用大肠杆菌poly(A)聚合酶对进行poly(A)加尾处理后进行纳米孔测序（图2e）。细胞来源与外泌体来源的糖基化RNA在RNA种类上呈现出显著相关性（图2f及扩展数据图4f）。这一发现印证了细胞RNA群体与外泌体RNA群体在糖基化修饰谱上具有高度一致性和相似性。

外泌体形成过程存在转运必需内体分选复合体(ESCRT)依赖性和非依赖性两种机制通路。HGS是ESCRT复合体的关键组分，而nSMase2对ESCRT非依赖性外泌体分泌至关重要(图3a)。已有文献表明，马诺霉素A(MA)能有效抑制ESCRT依赖性通路，且不影响细胞生长。GW4869对nSMase2的抑制会阻断外泌体释放。研究团队设计两种DsiRNA进行HGS敲低(图3b)，并使用MA和GW4869抑制剂处理。结果显示，HGS敲低及MA与GW4869处理导致外泌体glycoRNA减少（图3c,d），而HGS敲低组的细胞内glycoRNA相应增加(图3e)，表明外泌体释放受阻导致其携带的glycoRNA在胞质内累积。

外泌体介导的RNA转移已被证实是细胞间遗传物质交换的机制之一。为评估细胞通过外泌体定向传递glycoRNA的能力，将HeLa幼稚细胞分别与含/不含Ac4GalNAz标记的HeLa细胞外泌体共同培养1至20小时（图4a）。经过充分洗涤去除细胞外外泌体后，利用SPAAC显影细胞RNA。结果显示，共培养1小时后已经在HeLa幼稚细胞内检测出外泌体glycoRNA，并持续存在长达20小时（图4b）。由于Ac4GalNAz标记同时靶向外泌体表面糖蛋白，可通过活细胞SPAAC反应实现外泌体检测，并采用激光共聚焦扫描显微镜成像。如图4c所示，在处理1小时后，外泌体既存在于细胞膜表面也被内化至HeLa幼稚细胞内。随着时间推移，外泌体主要呈现内化状态，细胞膜上残留信号极少。这些结果确认了检测到的glycoRNA源自内化的外泌体。

负责糖修饰的特异性糖前体合成代谢通路中有两个关键酶——UDP-半乳糖-4-差向异构酶（GALE）和N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶(GNE)（图5a）。GALE作为核心酶介导UDP-GlcNAc与UDP-GalNAc的相互转化，其酶促反应产生的核苷酸糖对ER和高尔基体中的糖基化修饰至关重要。GNE将UDP-GalNAc和GlcNAc转化为N-乙酰-D-甘露糖胺(ManNAc)-6磷酸，这是影响细胞糖基化反应中的关键步骤。研究团队在HEK293T细胞中分别进行两组DsiRNA介导的GALE和GNE的敲低（图5b）。DsiRNA处理24小时后向培养基中添加Ac4GalNAz，继续培养48小时分离RNA，经琼脂糖凝胶电泳显影，结果显示GALE和GNE敲低后Ac4GalNAz水平升高（图5c）。额外添加GalNAc后，Ac4GalNAz标记糖基RNA的浓度降低，表明GalNAc是RNA糖基化的前体物质。研究团队进一步探索了聚糖与RNA的结合过程。已有研究表明，在蛋白质糖基化中寡糖基转移酶（OST）负责将分支糖转移到内质网中的蛋白质上，而特异性强效小分子抑制剂NGI-1能有效抑制这一过程。NGI-1处理后发现，Ac4GalNAz标记的细胞RNA和外泌体RNA均出现剂量依赖性的糖基化标记丢失（图5d）。这些数据表明，阻断蛋白质糖基化也会导致glycoRNA水平下降，暗示蛋白质与RNA糖基化之间可能存在协同调控机制。

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