《Ann Rheum Dis》IF 27.4丨云序生物acRIP-seq助力解析类风湿性关节炎治疗新靶点——NAT10
前言
类风湿性关节炎（RA）是一种慢性自身免疫性疾病，尽管生物制剂和靶向合成DMARDs显著改善了RA的治疗效果，但仍有超过30%的患者对当前治疗无反应，这表明存在未被识别的疾病发生途径。成纤维样滑膜细胞（FLSs）是滑膜微环境的关键组成部分，参与滑膜稳态和关节炎症及损伤。近期研究表明靶向FLSs可能是治疗RA的有效策略，但具体机制尚待确定。N4-乙酰胞嘧啶（ac4C）在调节mRNA稳定性和翻译效率方面发挥重要作用。NAT10介导的ac4C修饰对控制癌细胞的增殖、迁移和侵袭至关重要。研究NAT10介导的ac4C修饰在调节RA FLSs的功能和滑膜免疫细胞浸润中的作用，有望对类风湿性关节炎（RA）的治疗提供新的方向。
云序生物用户中山大学附属第一医院许韩师和肖游君团队在ANNALS OF THE RHEUMATIC DISEASES期刊（IF=27.4）发表题为“NAT10 promotes synovial aggression by increasing the stability and translation of N4-acetylated PTX3 mRNA in rheumatoid arthritis”的研究论文。研究聚焦类风湿性关节炎（RA）中NAT10介导的ac4C修饰作用，发现RA患者FLSs及滑膜的NAT10表达水平与ac4C修饰水平显著升高。NAT10敲低或抑制剂治疗可削弱RA FLSs迁移侵袭能力，并与滑膜免疫细胞浸润程度相关。动物实验显示敲低NAT10表达能减轻关节炎症状。机制上，NAT10通过促进PTX3 mRNA的ac4C增强其稳定性和翻译效率。这揭示NAT10介导的ac4C修饰在RA滑膜侵袭和炎症中发挥重要作用，表明NAT10有望成为治疗RA及FLSs失调疾病的潜在靶点。本研究中，云序生物有幸提供了acRIP-seq、mRNA-seq、ac4C-RIP-qPCR以及生信分析等服务。
标题：NAT10 promotes synovial aggression by increasing the stability and translation of N4-acetylated PTX3 mRNA in rheumatoid arthritis
发表时间：2024/08/27
发表期刊：ANNALS OF THE RHEUMATIC DISEASES
研究对象：滑膜组织（STs）、成纤维样滑膜细胞（FLSs）、II型胶原诱导性关节炎（CIA）大鼠（小鼠）模型
研究方法：acRIP-seq、RNA-seq、GO-BP、LC-MS/MS、Dot Blot、Western Blot、免疫荧光、Transwell检测、H&E染色与SO-fast染色等。
一、研究摘要
该研究旨在探究NAT10介导的ac4C修饰在类风湿性关节炎（RA）中的作用。研究者从RA患者中获取RA FLSs，通过蛋白质印迹、免疫组化或多重免疫组化检测蛋白表达；使用Boyden chamber测定细胞迁移能力；结合acRIP-seq与RNA-seq技术鉴定NAT10潜在靶点，并采用RNA免疫沉淀验证蛋白与mRNA的相互作用，分析了NAT10和ac4C的表达水平及其对RA FLSs迁移和侵袭能力的影响。研究发现，RA患者FLSs和滑膜中NAT10和ac4C水平升高，敲低NAT10或用NAT10抑制剂处理可降低RA FLSs的迁移和侵袭能力，且与滑膜中多种免疫细胞的浸润相关。在动物模型中，抑制NAT10活性可减轻关节炎症状。机制上，NAT10通过促进PTX3 mRNA的ac4C，增强其稳定性和翻译效率，进而调节RA FLSs的功能。研究结果表明，NAT10介导的ac4C修饰促进RA FLSs的侵袭并影响免疫细胞浸润，提示NAT10有望成为治疗RA及FLSs失调相关疾病的潜在靶点。
二、研究路线
三、研究结果
RA FLSs及滑膜组织中NAT10介导的ac4C修饰水平升高
检测健康对照组（HC）和类风湿关节炎患者组（RA）体内NAT10的表达，发现RA FLSs中NAT10的转录和蛋白表达水平均有所升高（图1 A, B）。免疫荧光显示NAT10定位于细胞核，且在RA FLSs中蛋白丰度更高（图1 C）。研究者通过LC-MS/MS和ac4C dot blot测定，确定了RA FLSs中ac4C的整体修饰水平高于HC FLSs（图1 D, E）。为验证NAT10是否调控RA FLSs中ac4C水平，研究者使用特异性siRNA或NAT10抑制剂remodelin进行干预，发现NAT10基因敲除或remodelin处理均能降低RA FLSs中ac4C的整体水平（图1 F, G）。进一步检测显示，RA患者滑膜组织中NAT10表达量显著高于HC组（图1 H）。并且发现滑膜组织NAT10表达水平与RA患者的疾病活动度评分（DAS28-ESR）呈正相关（图1 I）。通过多重免疫组化（mIHC）分析发现，NAT10主要在RA患者滑膜组织衬里层的PDPN+THY1-FLSs和亚衬里层的PDPN+THY1+FLSs中表达（图1 J）。这些结果表明，NAT10介导的ac4C修饰可能参与了RA的发病机制。
图1. RA患者FLSs及STs中ac4C水平与NAT10表达升高
A. RT-qPCR分析说明RA患者中NAT10表达水平比HC高。
B. Western Blot检测表明RA FLSs中NAT10蛋白表达比HC的高。
C. 免疫荧光染色检测NAT10定位于细胞核，且在RA患者中的表达量较高。
D. LC-MS/MS测定表明RA患者中FLSs中ac4C修饰水平比HC的高。
E. ac4C dot blot检测FLSs中ac4C水平，表明RA患者中FLSs中ac4C修饰水平比HC的高。
F. dot blot检测说明NAT10敲低降低ac4C的整体水平。
G. 使用remodelin抑制NAT10后，ac4C的整体水平降低。
H. 免疫组化染色显示：与HC组相比，RA患者滑膜组织中NAT10表达显著升高。
I. 滑膜组织NAT10表达IHC评分与RA患者疾病活动度评分(DAS28-ESR)呈正相关。
J. RA患者滑膜组织多重免疫荧光染色结果说明NAT10主要表达于RA患者滑膜组织衬里层的PDPN+THY1-FLSs和亚衬里层的PDPN+THY1+FLSs中。
NAT10调控RA FLSs的迁移与侵袭
进一步探究NAT10在调节RA FLSs功能中的作用，wound-healing测定表明NAT10敲低组的中迁移区域明显更小（图2 A, B）。同样，Transwell测定显示，NAT10敲低组中迁移的RA FLSs数量减少（图2 C, D）。此外，研究者还观察到NAT10敲除对细胞侵袭能力具有抑制作用。F-actin对控制细胞迁移至关重要，因此通过phalloidin染色检测NAT10对RA FLSs中F-actin改变的影响，明确了NAT10敲低抑制了RA FLSs前缘的lamellipodia 形成（图2 E）。同时，研究也发现remodelin处理减少了RA FLSs的迁移和侵袭、RA FLSs的lamellipodia形成（图2 F-I）。以上结果表明NAT10参与调节RA FLSs的侵袭。
图2. NAT10抑制对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞功能的影响
A. RA-FLSs细胞转染NAT10 siRNA 72小时后，通过Western Blot检测NAT10蛋白表达。
B-D. wound-healing和Transwell测定表明NAT10基因敲除降低RA-FLSs细胞迁移和侵袭能力。
E. NAT10基因敲除抑制了RA FLSs前缘的lamellipodia形成。
F-H. wound-healing和Transwell测定表明remodelin处理降低RA FLSs细胞迁移和侵袭能力。
I. remodelin处理减少了RA FLSs的lamellipodia形成。
RA FLSs中NAT10表达水平与滑膜免疫细胞浸润相关
据报道，NAT10与癌症TME中的免疫浸润相关。因此，研究者使用mIHC分析了高NAT10表达RA FLSs组与低NAT10表达RA FLSs组的免疫细胞浸润情况。在NAT10高表达组中，观察到树突状细胞（DCs）、T细胞和B细胞的浸润显著增加（图3），表明NAT10的表达水平与RA患者滑膜组织中免疫细胞浸润相关。
图3 NAT10对RA患者滑膜免疫细胞浸润的影响
A. 多重免疫荧光检测FLS标志物（PDPN和THY1）、内皮细胞标志物（CD31）、T细胞标志物（CD3、CD4、CD8和CD45RO）、B细胞标志物（CD20）、树突状细胞标志物（CD11c）及NAT10。
B. 高NAT10表达RA FLSs组与低NAT10表达RA FLSs组间PDPN+FLS中NAT10+PDPN+FLS的比例。
C. 高NAT10表达RA FLSs组相较于低NAT10表达RA FLSs组的免疫细胞亚型占比情况。
PTX3是NAT10在RA FLSs中的ac4C修饰靶标
与之前的报道一致，研究者发现在shNC和NAT10敲低的RA FLSs中ac4C修饰峰主要富集于mRNA的蛋白质编码区。为探究NAT10调控RA FLSs功能的内在机制，研究者在具有NAT10 shRNA的RA FLSs和具有对照shRNA（shNC）的RA FLSs之间进行acRIP-seq及RNA-seq（图4 A-D）。对低乙酰化基因和下调基因进行GO-BP富集分析，低乙酰化基因在细胞骨架组织等信号通路中显著富集，RNA-seq数据中下调基因与趋化作用相关（图4 E）。这些结果表明，NAT10能调控多个与细胞迁移和侵袭相关的基因，提示其在RA FLSs和免疫细胞迁移过程中起关键作用。将acRIP-seq及RNA-seq实验结果重叠分析（图4 F），与HC FLSs相比，RA FLSs中仅PTX3的表达存在显著差异，且PTX3在编码区和5'UTR结构域的乙酰化峰随着NAT10敲除而显著降低（图4 G），因此NAT10可能通过乙酰化PTX3 mRNA来调控RA FLSs的侵袭性行为。
研究者观察到在NAT10敲低的RA FLSs中，PTX3的mRNA和蛋白表达水平下降（图5 A, B）。为了探究NAT10介导的ac4C如何调控PTX3表达，通过acRIP-PCR实验，证明了PTX3 mRNA CDS和5'UTR区的ac4C在NAT10敲低后减弱（图5 C）。进一步研究表明NAT10通过增加PTX3 mRNA CDS和5'UTR的ac4C修饰直接调控PTX3表达（图5 D, E）。进一步研究表明，NAT10基因敲低后PTX3 mRNA显著降解，表明ac4C修饰的PTX3 mRNA更加稳定（图5 F）。进一步研究得到PTX3 CDS及5'UTR的ac4C修饰影响PTX3 mRNA的翻译效率（图5 G）。进一步通过NAT10 RIP-qPCR发现，经NAT10 siRNA处理的RA FLSs中，NAT10可与PTX3 mRNA结合，且NAT10敲低降低了这种结合能力（图5 H）。以上结果表明NAT10介导的ac4C通过调控mRNA稳定性和翻译效率来调节PTX3的表达。
图4. 通过acRIP-seq和RNA-seq对RA FLSs中ac4C修饰特征及NAT10下游靶点的鉴定
A. acRIP-seq实验流程示意图。
B. acRIP-seq分析RA FLSs细胞中shNC组和shNAT10组乙酰化转录本中ac4C峰值的分布情况，饼图展示。
C. RA FLSs细胞中shNC组和shNAT10组ac4C峰值的富集序列基序。
D. acRIP-seq和RNA-seq分析shNAT10转染组与shNC对照组在RA FLSs细胞中差异表达的ac4C峰值和差异表达基因。
E. GO-BP富集分析鉴定NAT10敲低后低乙酰化基因(左)与下调基因(右)的相关通路。
F. 重叠分析acRIP-seq和RNA-seq数据，寻找NAT10潜在下游靶点。
G. 根据acRIP-seq数据，与对照组相比，敲低NAT10的RA FLSs细胞中PTX3 mRNA的CDS区和5'UTR区的乙酰化峰降低。
图5. PTX3是RA FLSs中NAT10的修饰靶点
A. RT-PCR分析mRNA表达水平，在敲低NAT10的RA FLSs中，PTX3的mRNA表达量下降。
B. Western blot说明在敲低NAT10的RA FLSs中，PTX3的蛋白表达水平下降。
C. acRIP-qPCR技术检测说明shNAT10处理的RA FLSs中PTX3 mRNA 5'UTR(左)和CDS(右)的ac4C修饰水平降低。
D. 将野生型PTX3或突变NAT10结合位点的PTX3突变体(Mut1、Mut2)质粒分别转染至HEK-293T细胞。
E. 荧光素酶报告实验显示敲低NAT10显著降低了WT PTX3报告基因的荧光素酶活性，但对Mut1和Mut2报告基因没有影响。
F. mRNA转录抑制剂Act-D处理转染NAT10 shRNA或shNC的RA-FLSs细胞，说明NAT10基因敲除后mRNA显著降解。
G. 报告蛋白产量/mRNA丰度计算野生型与突变体PTX3的翻译效率。
H. NAT10 RIP-qPCR分析说明NAT10可与PTX3 mRNA结合，且敲低NAT10降低了这种结合能力。
PTX3在调节RA FLSs的迁移和侵袭以及免疫细胞滑膜浸润中的作用
检测发现，与HC FLSs相比，RA FLSs中PTX3 mRNA和蛋白表达水平显著升高（图6 A, B）。RA患者滑膜组织中PTX3水平也较健康组明显上升。为探究PTX3是否介导NAT10对RA FLSs功能的调控作用，研究者评估了敲低或过表达PTX3对RA FLSs迁移侵袭能力的影响。通过siRNA敲低PTX3表达发现，敲低PTX3可显著抑制细胞迁移侵袭能力（图6 C, D），并阻碍lamellipodia的形成，同时发现PTX3过表达可显著恢复NAT10敲除导致的细胞迁移侵袭能力下降（图6 E, F）。之后采用mIHC评估了PTX3高表达与低表达RA FLSs组间的免疫细胞比例。在PTX3高表达组中，观察到树突状细胞(DCs)、T细胞和B细胞的浸润显著增加（图6 G），同时发现RA患者滑膜组织PDPN+FLSs中NAT10与PTX3呈正相关（图6 H）。以上结果表明PTX3介导了NAT10诱导的RA FLSs的侵袭性。
图6. PTX3对RA FLSs迁移侵袭及滑膜免疫细胞浸润的影响
A. Western blot说明RA FLSs中PTX3的蛋白表达水平显著升高。
B. 免疫荧光染色显示PTX3在RA患者与HC滑膜组织中的定位与表达。
C-D. Transwell检测说明敲低PTX3可抑制细胞迁移侵袭能力。
E-F. Transwell检测说明PTX3过表达能回补NAT10沉默导致的细胞迁移侵袭能力下降。
G. 多重免疫荧光染色检测滑膜组织中FLSs标志物（PDPN与THY1）、内皮细胞标志物（CD31）、T细胞标志物（CD3、CD4、CD8及CD45RO）、B细胞标志物（CD20）、树突细胞标志物（CD11c）及PTX3的共定位情况。
H. 相关性分析说明RA患者滑膜组织PDPN+FLSs中NAT10与PTX3呈正相关。
敲低NAT10表达可以减轻RA模型中关节炎的严重程度
研究者建立了两种RA动物模型，即CIA大鼠/小鼠模型和DTHA小鼠模型（图7 A），以评估敲低NAT10表达对关节炎病程的影响。首先构建了稳定表达NAT10-shRNA（Adv-NAT10）或对照shRNA（Adv-Ctrl）的慢病毒颗粒，并将其注射到患有CIA大鼠膝关节中。结果显示，与对照组相比，Adv-NAT10治疗组的关节炎评分降低，后爪体积和踝周长减小（图7 B-E），显微CT和X线检查显示骨破坏减轻，滑膜增生及软骨和骨破坏减少（图7 F, G）。此外，局部关节内NAT10敲低降低了CIA大鼠滑膜组织中NAT10和PTX3的表达（图7 H, I）。这些结果表明敲低NAT10表达可有效减轻RA动物模型的关节炎症状。
研究者进一步探究了remodelin 对CIA小鼠病情严重程度的影响（图8 A, B）。研究发现，用remodelin治疗的小鼠关节炎评分显著低于对照组，且滑膜炎症、增生、骨侵蚀及软骨破坏程度均有所减轻（图8 C, D）。进一步采用NAT10杂合缺失小鼠（NAT10+/-）构建了迟发型超敏性关节炎（DTHA）模型（图8 E, F）。结果显示，与野生型小鼠相比，NAT10+/-小鼠的足爪肿胀程度和关节炎评分显著降低，滑膜炎症、增生、骨侵蚀及软骨破坏程度也得到显著改善（图8 G-I）。这些结果表明，remodelin治疗和NAT10杂合缺失均可有效减轻关节炎症状，提示NAT10可能是治疗RA的潜在靶点。
图7. 关节腔内注射NAT10 shRNA对CIA大鼠关节炎严重程度的影响
A. CIA大鼠模型的诱导及干预方案示意图。
B. 各组踝关节的代表性图像。
C-E. 通过临床关节炎评分(C)、爪容积测量(D)和踝关节周长(E)量化CIA大鼠踝关节肿胀程度，表明Adv-NAT10治疗组的关节炎评分降低，后爪体积和踝周长减小。
F. 通过显微CT分析骨表面与骨体积比（BS/BV）评估CIA大鼠骨侵蚀情况，表明Adv-NAT10治疗组骨破坏减少。
G. H&E染色与SO-fast染色评估关节病理变化说明Adv-NAT10治疗组滑膜增生及软骨和骨破坏减少。
H-I. 免疫荧光染色表明局部关节内敲低NAT10降低了CIA大鼠滑膜组织中NAT10和PTX3的表达。
图8. remodelin治疗及NAT10敲低对CIA和DTHA模型小鼠关节炎严重程度的影响
A. CIA小鼠模型的诱导与干预方案示意图。
B. 各组踝关节的代表性图像。
C. 通过临床关节炎评分量化CIA小鼠踝关节肿胀程度，发现用remodelin治疗的小鼠关节炎评分显著低于对照组。
D. H&E染色与SO-fast染色评估关节病理变化，说明用remodelin治疗的小鼠滑膜炎症、增生、骨侵蚀及软骨破坏程度均有所减轻。
E. 野生型与NAT10+/-小鼠DTHA模型诱导方案示意图。
F. 各组踝关节的代表性图像。
G-H. 通过临床关节炎评分(G)和Δ厚度值(H)量化踝关节肿胀程度，表明NAT10+/-小鼠的足爪肿胀程度和关节炎评分显著降低。
I. H&E染色与SO-fast染色评估关节病理变化，说明NAT10+/-小鼠的滑膜炎症、增生、骨侵蚀及软骨破坏程度也得到改善。
J. NAT10介导ac4C修饰调控FLS介导的滑膜侵袭及RA免疫微环境异常的作用机制示意图。
四、全文小结
RA FLSs及滑膜组织中NAT10介导的ac4C修饰水平升高
· RA FLSs中NAT10的转录和蛋白表达水平显著高于健康对照组（HC），LC-MS/MS和ac4C dot blot测定，RA FLSs中ac4C的整体修饰水平高于HC FLSs。
· 使用特异性siRNA或NAT10抑制剂remodelin干预后，RA FLSs中ac4C的整体水平显著降低。
PTX3是NAT10在RA FLSs中的ac4C修饰靶标
· acRIP-seq和RNA-seq分析重叠的NAT10在低乙酰化基因组和下调基因组的潜在下游靶点。
· NAT10通过PTX3 mRNA CDS和5'UTR的ac4C修饰直接调控PTX3表达。NAT10介导的ac4C乙酰化通过调控mRNA稳定性和翻译效率来调节PTX3的表达。
PTX3在调节RA FLSs的迁移和侵袭以及免疫细胞滑膜浸润中的作用
· PTX3敲低显著抑制RA FLSs的迁移和侵袭能力，并阻碍lamellipodia的形成。PTX3过表达可回补NAT10敲除对细胞功能的抑制作用。
· PTX3高表达组中树突状细胞（DCs）、T细胞和B细胞的浸润显著增加。RA患者滑膜组织PDPN+FLSs中NAT10表达水平与PTX3呈正相关。
敲低NAT10表达可以减轻RA模型中关节炎的严重程度
· 与对照组相比，NAT10敲低组的关节炎评分降低，后爪体积和踝周长减小。显微CT和X线检查显示骨破坏减轻，滑膜增生及软骨和骨破坏减少。
· 局部关节内NAT10敲低降低了CIA大鼠滑膜组织中NAT10和PTX3的表达。
机制通路整合
NAT10介导PTX3 mRNA CDS和5'UTR的ac4C修饰 → PTX3表达增加 → PTX3调控RA FLSs的侵袭和免疫细胞滑膜浸润 → 敲低NAT10减轻RA模型关节炎症状
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