2.1 R-loop介导转录调节：

(1) R-loop发挥“类启动子”功能，促进基因转录

当新生RNA链侵入DNA双链形成R-loop结构时，新生RNA链可作为反义lncRNA的启动子元件，同时R-loop结构中的游离单链DNA可作为转录模板，从而促进哺乳动物基因组中的反义转录。

(2) R-loop通过促进/阻碍转录因子调节转录起始

R-loops可以通过影响转录因子的结合，在调节转录启动方面发挥着关键作用。一方面，R-loops会阻碍转录因子的结合，从而抑制转录的启动。另一方面，R-loops也能促进转录因子的结合或阻断转录抑制因子的结合，从而导致转录增强。这种调控机制的一个典型案例体现在VIM基因的转录过程，反义lncRNA VIM-AS1在VIM基因的启动子区域形成R-loop并招募和增强转录激活因子NF-κB的结合，从而促进了VIM基因的转录。

(3) 驻留R-loop抑制转录延伸

在各种生物体中，驻留R-loop可以对转录延伸产生影响。例如，在正常生理条件下，Snord116基因中R-loop的形成会通过非编码RNA Ube3a-ATS促进神经元中转录复合体的表达，进而沉默Ube3a基因。然而，当药物导致过量的R-loop形成时，会使过量的转录复合物停滞，进而抑制Ube3a-ATS的转录延伸，并因此促进Ube3a基因的表达。

(4) R-loop的形成导致转录暂停/终止

许多研究表明，R-loop可通过各种机制导致转录终止，如促进Pol II在3' 端悬浮或招募特定的终止蛋白来实现转录终止。最近的研究结果表明，RNA的m6A修饰可能在增强R-loop的形成方面发挥作用，并进而有助于转录终止过程。例如，circSMARCA5与其母基因座结合产生R-loop，导致SMARCA5第15号外显子的转录停止。这种干扰导致有缺陷的转录本产生并转化为截短的无功能蛋白质，随后被降解，最终破坏DNA损伤修复过程。然而，R-loop导致转录暂停的调控机制目前仍不清楚，有待进一步探索和验证。

2.2 R-loop介导表观基因组学调控

(1) R-loop调控DNA甲基化

全基因组检测发现，在DNA甲基化程度降低、DNase敏感性增加的位点，R-loops的含量更高，这可能暗示R-loops与DNA甲基化调控有关。进一步的研究发现，基因启动子区域形成的R-loops会阻碍DNA甲基转移酶与DNA的结合，从而阻碍启动子区域的DNA甲基化并促进进一步转录。

(2) R-loop调节染色质构象变化

R-loops可以通过直接招募染色质修饰复合物来影响染色质构象变化。例如，lncRNA HOTTIP通常在急性髓系白血病中高表达，并在TADs的形成中发挥作用，TADs是染色质DNA空间折叠形成的高级结构，能够影响启动子和增强子的功能导致TADs内的基因表达增强，进而促进肿瘤的发生和发展。机制研究表明，HOTTIP能够在TAD边界上通过反式作用，在β-catenin基因两侧的两个不同CTCF蛋白结合位点形成R-loop。通过招募CTCF等与TAD形成相关的蛋白到相应位置，直接强化了CTCF染色质边界并促进包含β-catenin基因的TAD形成，从而驱动癌基因转录和白血病的发展。

此外，R-loops可以作为某些单链lncRNA的锚，招募染色质重塑复合物。例如，反义lncRNA GTAT3-AS1能够在GATA3基因和GATA3-AS1的共启动子区域形成R-loop，同时，单链GATA3-AS1能将MLL蛋白招募到GATA3基因的启动子区域，并通过组蛋白H3K4me3修饰来增强GATA3基因的转录。

2.3 反式R-loop参与基因表达调控

反式R-loops是通过新生RNA链与远处的DNA链（如基于非编码RNA和引导RNA的DNA链）杂交形成的。反式R-loops可以在整个基因组的多个位置形成，导致出现多个基因组不稳定的热点。因此，与顺式R-loops相比，反式R-loops对基因组完整性的威胁更大。

lncRNA APOLO负责拟南芥中生长素反应基因的激活。APOLO靶向的基因通常都处于沉默状态，且被多梳因子样异染色质蛋白1（Polycomb factor like heterochromatin protein 1，LHP1）维持在沉默状态。对生长素响应的APOLO转录激活后，APOLO识别其靶基因启动子区的特异性基序，结合在靶基因的启动子区形成R-loop，并锚定在靶基因的启动子区。同时，单链的APOLO RNA作为LHP1的诱饵，从而促进靶基因表达。

2.4 R-loops检测技术

目前，R-loops在基因组中的定位主要通过基因组单位点或全基因组测序来检测。单点R-loop检测方法的通量较低，无法满足全面识别全基因组R-loops的研究需求。基于第二代高通量测序技术开发的用于全基因组R-loops分析的高通量检测技术，主要利用能识别RNA:DNA杂交链的蛋白质或抗体。通过富集RNA:DNA杂交链，然后进行文库制备和测序分析，可以获得R-loop的精确图谱和半定量信息。

针对全基因组范围内的R-loops检测，云序生物提供DRIPc-seq和ssDRIP-seq两种技术服务。

云序生物DRIPc-seq是一种基于抗体富集，RNA反转录链建库的“DNA:RNA杂合链免疫共沉淀及高通量测序技术”，利用针对R-Loop结构中的RNA链反转录进行建库测序，能够在全基因组范围内检测R-Loop结构中的RNA链；针对长链mRNA、LncRNA及circRNA的链特异性检测。

云序生物ssDRIP-seq是一种基于抗体富集，单链DNA建库的“DNA:RNA杂合链免疫共沉淀及高通量测序技术”，利用针对R-Loop结构中的ssDNA链建库测序，能够在全基因组范围内检测R-Loop结构中的DNA链，同时设置RNase H文库，确保建库DNA非基因组DNA。

云序生物DRIPc-seq & ssDRIP-seqq技术具有高分辨、高灵敏、高特异性的特点。适用于包括免疫、神经和发育、植物生长和代谢等在内的各种生命科学和医学领域的研究。

随着测序技术和生物信息学的不断进步，大量研究表明，R-loop与各种疾病（包括神经系统疾病、癌症和其他疾病）有直接关联。这些发现可能会为相关疾病的治疗提供新的靶点和策略。

3.1 m6A修饰影响RNA加工和输出

m6A可通过招募调节剪接的RNA结合蛋白（RBPs）或直接影响RBP与目标RNA的相互作用，进而促进前体mRNA的选择性剪接。此外，m6A修饰在核内选择性聚腺苷酸化（APA）和miRNA生物发生中发挥作用。同时，m6A修饰还会影响mRNA的核输出过程。例如，m6A阅读蛋白YTHDC1与下游蛋白SRSF3形成RNA-蛋白复合物，后者选择性地与NXF1结合，促进m6A修饰的mRNA向细胞质输出。

3.2 m6A修饰调控RNA翻译

3.3 m6A修饰调节RNA的稳定性和衰变

3.4 m6A修饰的染色质调控和转录调控

3.5 m6A检测方法

目前，m6A的主要测序方法仍依赖于基于抗体的RNA甲基化测序，如甲基化RNA免疫沉淀（MeRIP）。然而，这些方法有明显的局限性，包括分辨率低、缺乏定量、易出现假阳性等诸多问题。

众所周知，抗体特异性的强弱是决定MeRIP实验是否成功的关键，没有Spike-In，将难以确定实验是否成功、有效RNA是否富集，也难以确定RNA甲基化修饰的丰度和变化，进而无法保证测序结果真实可靠、质量达标。可以说，一次高质量MeRIP实验的关键就在于质控“金标准”Spike-In的加入。

针对传统m6A MeRIP-seq的技术痛点，云序生物推出m6A MeRIP-seq (Spike-In Plus)技术服务。云序生物在传统m6A MeRIP-Seq实验流程中加入两类人工合成的Spike-In，分别为阳性Spike-In（带m6A修饰的序列）和阴性Spike-In（不带修饰的序列），与样品一起进行MeRIP-Seq实验，根据Spike-In的检测信号对MeRIP实验进行质控，来确保实验流程的准确性、重复性及抗体的特异性。

针对传统m6A MeRIP-seq分辨率低的问题，多年来，人们不断尝试开发m6A修饰单碱基测序方法。2022年10月27日，北京大学王晶与伊成器课题组联合在《Nature Biotechnology》杂志上在线发表了题为“Absolute quantification of single-base m6A methylation in the mammalian transcriptome using GLORI”的研究成果，展示了GLORI技术在单碱基识别m6A的优异表现，确立了GLORI技术在m6A修饰单碱基测序领域的“金标准”地位。

云序生物通过对比市面上现有的各种m6A测序技术的优缺点（详见下表），敏锐意识到GLORI技术相较于其它测序技术的巨大优势，并于2024年6月正式获得北京大学GLORI技术的授权。

云序生物m6A GLORI-seq技术服务不依赖于抗体，通过乙二醛和亚硝酸盐的催化体系，对未甲基化的腺苷进行高效地脱氨从而形成肌苷(A-to-I, > 98%)，肌苷在测序过程中被读成鸟苷(G)，形成A-to-G的转化；而m6A测序后仍被读成A，从而实现对m6A的单碱基识别。同时，在文库准备过程中引入了唯一分子识别符(UMI)序列，消除逆转录过程中由扩增效率引起的偏差，实现m6A的绝对定量。相较于其它m6A检测技术，m6A GLORI-seq实现了对m6A修饰位点的99.9%的检测，范围更广。

云序生物m6A GLORI-seq技术服务实现了真正意义的高效率、高灵敏度、高特异性、无偏好单碱基m6A位点检测，并对m6A位点的修饰水平进行绝对定量。

随着m6A-seq技术的不断应用和改进，我们对全转录组水平m6A修饰的认识取得了重大进展。它已成功应用于各种功能研究，揭示了m6A修饰在调控RNA剪接、翻译和稳定性方面的关键作用。此外，它还揭示了m6A修饰的进化保守性、组织特异性、对应激的反应以及其他显著特征。

各类m6A测序方法优缺点一览表

近年来，m6A修饰与R-loop之间的关系成为研究热点。概括来说，m6A修饰与R-loop之间的关系主要体现在以下几个方面：

（1）m6A修饰能够调节R-loop的平衡，在维持基因组稳定性方面发挥作用。m6A修饰能促进RNA转录过程中R-loop的形成。研究表明，m6A修饰可以改变RNA的二级结构，使RNA在转录过程中更容易与DNA相互作用，从而促进R-loop的产生。同时，m6A修饰还可促进R-loop的清除，防止R-loop介导的基因毒性应激反应。

（2）在细胞应激或损伤条件下，m6A修饰与R-loop之间的相互作用可能在DNA修复和基因表达反应中发挥重要作用。在某些情况下，R-loop可以促进DNA修复，而m6A修饰则可以调节这一过程。

（3）m6A修饰还能促进共转录R-loop以抑制pol II的读通活性，从而促进转录终止。

总之，m6A修饰与R-loop之间的相互作用为理解RNA生物学和基因表达调控提供了一个新的视角，未来的研究可能会揭示这些相互作用的更多机制及其在各种疾病中的潜在作用。

在癌细胞中，研究人员观察到来自各种RNA的R-loop的异常积累。R-loop可能会通过改变基因表达和加剧基因组不稳定性而导致癌症进展。例如，有研究发现，张力响应增强子结合蛋白（TonEBP）利用Rel同源结构域（RHD）将METTL3募集到R-loop中，以促进RNA的m6A修饰。在紫外线或喜树碱暴露条件下，TonEBP或METTL3的耗竭都会导致R-loop形成增加和细胞存活率下降。

考虑到m6A修饰与R-loop之间的密切联系，因为两者都参与基因表达调控、癌症发生和发展，因此研究m6A修饰的R-loop在癌症中的作用机制至关重要。这些研究可能会为了解癌细胞基因组不稳定性的起源提供有价值的见解，并为开发靶向治疗方法做出贡献。然而，关于这一主题的现有研究还很少。因此，文章通过进一步研究前列腺癌、骨髓增生综合征、神经母细胞瘤和ARID1A异常癌症的发病机制，揭示m6A修饰的R-loop在癌症发生发展中的重要作用。

4.1 前列腺癌

前列腺癌（PCa）是发病率第二高的癌症，也是导致男性癌症相关死亡的第五大原因。因此，对PCa发生发展的分子机制的研究至关重要。

近期的一项研究显示，共转录R-loop介导的表观遗传调控可驱动晚期PCa的生长迟缓。研究表明，IGF2BPs以m6A依赖性方式识别并结合R-loop。此外，IGF2BPs的KH结构域对于识别含m6A的R-loop和发挥肿瘤抑制功能至关重要。

机制研究表明，METTL3和RBM15作为m6A修饰的关键调节因子，共同诱导PCa中R-loop的m6A甲基化。随后，IGF2BPs选择性地与m6A修饰的R-loop结合并阻止YTHDF2与这些R-loop结合，导致PCa中R-loop水平升高。同时，IGF2BPs还能阻碍DNA甲基转移酶1（DNMT1）与SEMA3F基因启动子的结合，从而保护SEMA3F基因免受干扰，促进SEMA3蛋白的产生。SEMA3进而发挥激活Hippo通路、抑制肿瘤发生、血管生成和组织生长抑制等作用。

近年来，随着检测技术的进步，人们逐渐意识到R-loops和m6A修饰在癌症和其他各种疾病中的重要作用。然而，对这两个因素在癌症中综合作用的研究仍处于探索阶段。

本文通过对四种类型癌症的相关分子机制进行解析，证明了经m6A修饰的R-loops可通过不同的分子机制发挥抗癌或促癌作用。这些发现表明了R-loops的m6A修饰在癌症发生和发展中的重要性，并展示了其潜在的临床应用价值。同时，这提醒我们，不同的RNA修饰可能共同发挥作用，作为某些疾病的“幕后推手”，而更为灵敏、准确、高效的RNA修饰检测手段则是实现这些研究的前提。

云序生物作为国内首家提供RNA修饰测序类服务商，历经10余年积累，目前已经发展成为RNA修饰测序服务最全的平台，提供各类RNA修饰（m6A、m5C、ac4c、m7G、m1A、2’-O、5hmc、m6Am、假尿嘧啶、RNA糖基化），各类RNA分子（mRNA及非编码RNA），各类测序技术（IP类，单碱基类）及eccDNA系统性解决方案。截至目前，云序生物已经参与发表200篇+RNA修饰类文章，累计影响因子1700+，提供技术服务涵盖了医口以及农口等各领域，累计近200多种物种。

未来，云序生物将持续聚焦科研前沿领域，致力于用最前沿的检测技术为客户提供最优质的服务，助力每一次科研突破！

结论和展望

RNA修饰测序是云序生物转录调控及表观组学旗下的重磅产品。在国内，目前云序生物具有最全的RNA修饰测序平台，可提供m6A、m5C、m1A、m7G、m3C、O8G、m6Am、ac4C乙酰化、2'-O-甲基化和假尿嘧啶等各类热门修饰的多种测序技术，包括IP类和单碱基分辨测序，涵盖各类RNA分子，如mRNA、lncRNA、circRNA、tRNA、rRNA、miRNA及pri-miRNA等非编码RNA的MeRIP-seq服务。通过不断迭代优化，目前RNA修饰测序平台适用于各类物种，组织及RNA起始量的个性化需求。同时，云序生物还在线出售m6A、m5C、m1A、m7G、O8G、ac4C的IP试剂盒。

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