单细胞转录组测序（scRNA-seq）

（一）技术简介

scRNA-seq通过检测单个细胞中的mRNA表达谱，实现细胞类型鉴定、细胞状态分析以及细胞发育轨迹研究。

（二）测序流程

scRNA-seq的核心突破在于实现单个细胞的独立分离、标记与转录组捕获，从而获得细胞分辨率的基因表达图谱。

云序生物单细胞测序平台基于先进的液滴微流控技术，通过微流控系统将单个细胞、带有细胞barcode（分辨单个细胞的标记序列）的微球以及反应体系精准封装于独立液滴中，形成独立的单细胞反应单元。其中，云序生物自主优化的微球-分子标签技术可提供千万级别高复杂度分子标签，实现高效转录本捕获和稳定的单细胞文库构建，为大规模细胞群体解析提供可靠技术支持。

整体流程包括：

（三）技术优势

1. 高效细胞捕获，精准解析细胞异质性

采用优化的微流控分区体系，可实现80%的细胞捕获效率，帮助研究者发现低丰度细胞群体及细胞状态差异。

2. 低双胞率，提高单细胞数据准确性

优化细胞分散及液滴生成体系，实现双胞率＜5%，提高细胞注释和下游分析可靠性。

3. 高灵敏度转录本检测，挖掘低丰度基因表达

基于高复杂度barcode体系和高效mRNA捕获策略，提高单细胞转录本检测能力，有助于发现稀有细胞亚群及关键调控基因。

4. 高重复性，保障实验结果稳定可靠

标准化建库流程和稳定的微流控体系降低批次间差异，保证不同实验批次间数据一致性，满足多样本、多组学联合分析需求。

（四）可解决哪些科学问题？

• 细胞组成解析：组织中有哪些细胞类型？

• 细胞亚群分析：同一细胞类型可以分为哪些不同亚型？这些亚型分别处于什么功能状态？

• 稀有细胞发现：是否存在关键少数细胞群？

• 细胞通讯研究：细胞之间如何通过分子信号相互影响？

Illumina即时分区单细胞转录组测序（PIP-seq）

（一）技术简介

微流控平台适用于标准化、高稳定性的单细胞转录组研究；PIP-seq技术凭借无需微流控设备、高通量和高灵活性的特点，为珍贵样本、大规模细胞图谱研究提供了新的技术选择。整套实验无需专用精密仪器，仅通过实验室常规设备即可完成单细胞捕获与文库构建。该方案可灵活实现数百至百万级细胞的单细胞捕获测序，兼具高性价比、多样本兼容、低样本损耗的突出优势。

（二）测序流程

1. 样本准备：制备高质量单细胞或单细胞核悬液，并调整至适宜浓度。

2. 细胞捕获与乳化：将细胞悬液与带有细胞barcode的模板颗粒及油相混合，通过涡旋振荡生成单分散液滴，实现单细胞的分区包裹。

3. 细胞裂解与mRNA捕获：加热激活蛋白酶K使细胞裂解，释放的mRNA被水凝胶微球上的条形码poly(T)寡核苷酸捕获。

4. 逆转录与cDNA扩增：在微球上直接进行逆转录合成cDNA，随后进行全转录组扩增。

5. 文库构建与高通量测序：纯化cDNA并构建测序文库，通过高通量测序获得单细胞基因表达谱信息。

（三）技术优势

1.样本兼容范围广：

云序生物PIP-seq采用Illumina商业化试剂盒，可处理从100个到100万个量级的细胞。不仅适配常规足量组织、细胞系、血液样本，也可适配分选的稀有细胞、微量原代细胞、少量临床穿刺样本等低细胞量珍贵样本。

2.性价比高：

PIP-seq打破传统单细胞测序固定通量、统一高价计费的模式，根据细胞数量选择特定的试剂盒，性价比高。

3.数据精准可靠：

PIP-seq技术体系成熟稳定，水凝胶微球标记均一性强、mRNA捕获效率高，双胞率低至约2%。与传统微流控单细胞平台相比，二者在细胞分群效果、特征标记基因筛选、稀有细胞鉴定、差异表达分析等核心结果上高度一致，数据重复性与可信度高。

4.高效细胞捕获策略，样本损耗低：

PIP-seq采用涡旋乳化的方式进行单细胞捕获，整个流程操作简便、样本处理时间短、死细胞损耗低、转录本扰动小。该策略尤其适用于细胞量有限或状态脆弱的珍贵样本，最大程度保留其原始生物学信息。

（四）可解决哪些科学问题？

当样本量有限时，如何最大程度挖掘单细胞层面的分子信息？

如何在百万级细胞规模下全面描绘单细胞图谱？

如何从单个样本研究走向大规模队列水平的细胞图谱分析？

单细胞ATAC测序（scATAC-seq）

（一）技术简介

scATAC-seq揭示“哪些基因区域具备表达潜能”，scChIP-seq进一步解析“哪些染色质调控因子正在发挥作用”，二者结合可从染色质结构和调控机制层面全面解析细胞功能形成过程。

传统ChIP-seq（Chromatin Immunoprecipitation sequencing）通过抗体富集特定蛋白结合的DNA区域，可用于解析组蛋白修饰和转录因子结合位点。单细胞ChIP-seq（single-cell ChIP sequencing, scChIP-seq）通过在单细胞水平检测特定染色质蛋白或组蛋白修饰的分布特征，实现细胞特异性的表观遗传图谱构建。

（二）测序流程

1. 通过对细胞悬液处理，增加细胞膜通透性。

2. 加入一抗结合修饰位点，加入二抗扩大信号。

3. 修饰过的PA-Tn5酶结合二抗，PA-Tn5酶靶向切割DNA。

4. 通过液滴微流控技术将经过处理的单细胞包裹形成油包水结构，进行预扩增以捕获和标记单个细胞的DNA。

5. 经过PCR扩增加上测序接头，构建成文库进行高通量测序。

（三）技术优势

1. 单细胞分辨率解析表观遗传异质性

传统ChIP-seq只能获得群体平均信号，难以发现不同细胞间的调控差异。scChIP-seq能够解析不同细胞的表观遗传特征，实现从“群体平均”到“单细胞精细解析”的突破。

2. 高度并行化分析，保障数据质量与细胞间可比性

该技术通过微流控平台，将成千上万个单细胞置于完全相同的反应体系中，同步完成细胞标记、免疫沉淀和文库构建，可在一个实验中高度并行地分析所有细胞间的表观遗传差异。

（四）可解决哪些科学问题？

不同细胞的表观遗传状态有何差异？

哪些表观遗传机制驱动细胞状态变化？

哪些分子开关控制关键基因表达？

OCT空间转录组测序

（一）技术简介

云序生物OCT空间转录组测序专为OCT包埋的新鲜冷冻（Fresh Frozen, FF）组织或固定冷冻（Fixed Frozen）样本设计，在6×6 mm的空间表达芯片上采用polyT高效捕获+原位转印技术，凭借优化后的微球表面偶联工艺与反应动力学，极大提升了对低丰度转录本（如转录因子、非编码RNA）的捕获效率。目前已在人、小鼠、大鼠、猪、兔子、鸡及哺乳动物样本中得到广泛验证。即使在高度复杂的神经系统或高度异质性的软骨组织中，依然保持着极高的基因检出率，让每一个分子信号都清晰可见。

（二）测序流程

1.组织切片与贴片

将OCT包埋组织切片后贴附于空间转录组芯片上，保持组织原始形态和空间结构；

2.组织染色与成像

对组织切片进行ssDNA/HE染色，并采集高分辨率组织图像，为后续空间定位和结果可视化提供依据；

3.组织透化与mRNA捕获

对组织进行透化，使细胞内mRNA释放，mRNA被芯片表面的空间条形码（Spatial Barcode）捕获，每个转录本携带对应的空间位置信息；

4.文库构建及测序

对捕获的RNA进行逆转录、cDNA合成、扩增及建库测序，获取基因表达信息与空间坐标信息；

5.生物信息学分析

利用空间条形码将测序数据映射回组织原始位置，构建组织空间基因表达图谱，并完成数据质控、空间聚类（Spatial Domain）、空间差异表达分析及细胞分群等分析。

（三）技术优势

1、单细胞级空间分辨率，兼顾多尺度组织解析

采用10μm捕获点间距，接近单细胞空间分辨率，可精准解析组织中不同细胞群的空间分布。同时支持10–100μm多级分辨率分析，能够根据研究需求灵活实现单细胞、细胞群及组织区域等不同尺度的空间表达分析，兼顾精细解析与整体组织结构研究。

2、大面积芯片设计，提高组织覆盖能力

提供3mm、6mm和10mm等多种芯片规格，可灵活适配小鼠脑、胚胎、肿瘤切片以及大尺寸临床组织样本，兼顾高分辨率研究与大视野空间解析，减少重复实验，提高组织利用率。

3、超高探针密度，提高基因检出率

单芯片上分布约11000个捕获点（spot），每个捕获点可配置30万/100万级空间捕获探针，具有更高的空间采样密度和RNA捕获能力，可有效提升UMI数、基因数及低表达基因的检测能力，为后续空间聚类、细胞类型注释及差异分析提供更加丰富的数据支撑。

4、高灵敏度RNA捕获，低丰度基因不遗漏

凭借优化后的微球表面偶联工艺与反应动力学，大幅提升了RNA捕获效率，对转录因子、细胞因子、非编码RNA等低丰度转录本具有更高检出能力。已在人、小鼠、大鼠、猪、兔、鸡等多种物种样本中得到充分验证，即使面对神经组织、软骨等复杂组织，依然保持优异的基因检出率，让更多生物学信息得以保留。

（四）可解决哪些科学问题？

OCT空间转录组适用于OCT包埋的新鲜冷冻组织。由于RNA完整度较高，可实现较全面的空间转录组检测，适合探索组织中细胞组成、功能状态及空间微环境，从而回答：

组织中有哪些细胞？它们分别位于哪里？

组织不同区域的基因表达有何差异？

肿瘤微环境如何组织？不同区域为何呈现不同的生物学特征？

不同细胞之间如何发生空间互作？

FFPE空间转录组测序

（一）技术简介

福尔马林固定石蜡包埋（Formalin-Fixed Paraffin-Embedded，FFPE）样本是临床病理最广泛保存的样本类型，兼具丰富临床信息与长期保存优势，但福尔马林固定导致的RNA片段化与交联，使其空间转录组检测面临挑战：RNA完整性差，Poly(T)捕获效率低；灵敏度与基因检出数下降；组织降解异质性强，实验稳定性要求高；数据质量波动大，影响后续细胞注释、空间分区及互作分析。

云序生物FFPE空间转录组测序专攻FFPE临床存档样本，在6×6 mm的空间表达芯片上使用高特异性双探针杂交+原位转印技术，逆转“降解”困局。不仅完全贴合医院标准的病理制片规范，还具备以下优势：

• 高敏表现：针对3年内的临床存档石蜡组织，双探针设计能精准锁定降解片段，实现信号的高效级联放大。

• 超越国际标杆：在脑、甲状腺、肾脏、肝脏、肠道、卵巢、胰腺、膀胱、肺、乳腺以及极难处理的软骨、类器官等临床样本实测中，基因检出率与灵敏度表现突出，显著优于目前市面上的国际标杆品牌。

（二）测序流程

1.FFPE切片制备

FFPE切片、HE染色、组织成像及感兴趣区域（Region of Interest，ROI）确认；

2.cDNA文库制备

特异性探针原位杂交、酶联、预扩增；

3.文库质控

构建测序文库，针对片段长度分布及目标基因覆盖等进行质检；

4.高通量测序

同时获取转录本序列信息及对应的空间信息；

5.生物信息学分析

利用空间条形码将测序数据映射回组织原始位置，构建组织空间基因表达图谱，并完成数据质控、空间聚类（Spatial Domain）、空间差异表达分析及细胞分群等分析。

（三）技术优势

1、10μm高空间分辨率，精准解析组织微环境

捕获点中心间距仅10μm，接近单细胞空间尺度，可精细解析组织空间异质性及细胞微环境。同时支持10–100μm多级分辨率分析，兼顾局部细胞互作解析与组织整体空间结构研究。

2、30万+特异性探针覆盖，检测灵敏度更高

基于人转录组设计高特异性RNA探针，在6×6 mm的空间表达芯片上铺设了约10000个捕获点（直径10μm），每个捕获点配置超过30万条探针。探针直接靶向编码区（CDS）进行RNA捕获，不依赖Poly(A)尾完整性，显著提升RNA捕获效率和低丰度转录本检出能力，在RNA质量较差的FFPE样本中仍可获得稳定可靠的检测结果。

3、充分释放FFPE样本研究价值

FFPE空间转录组测序采用优化的探针捕获策略，有效克服RNA降解带来的检测限制，实现珍贵临床病理样本的高质量空间转录组分析，为回顾性研究和临床队列研究提供可靠的数据支持。

4、兼容医院病理标准流程

无需改变医院现有FFPE制样流程，珍贵临床病理样本无需重新取样，可直接利用常规保存的FFPE组织开展空间转录组检测。

（四）可解决哪些科学问题？

FFPE空间转录组适用于临床病理中广泛保存的FFPE样本。其核心价值不仅是获得空间表达信息，更在于能够激活大量具有病理诊断和长期随访信息的历史样本资源，从而回答以下问题：

如何从既有病理样本中挖掘空间分子信息？

不同病理区域的分子特征有何差异？

哪些空间免疫特征可能与治疗效果或疾病预后相关？

如何将空间组学研究从少量新鲜样本拓展至大规模临床队列？

多重荧光免疫组化（mIHC）

（一）技术简介

多重荧光免疫组化（mIHC）技术基于酪胺信号放大（Tyramide signal amplification, TSA）系统，利用辣根过氧化物酶（HRP）对靶蛋白或核酸进行高密度原位标记，实现酶促信号级联放大，能够在同一张OCT/FFPE组织切片上实现多靶标的同时检测。一张切片可呈现1-8个靶标蛋白标记，结合DAPI可达到9色检测，既高效节约珍稀样本，又能全面获取细胞表型与空间分布信息。

（二）实验流程

1. 特异性一抗与目标抗原结合后，HRP标记的二抗与一抗结合；

2. 加入的酪胺荧光素底物在HRP和过氧化氢作用下被激活；

3. 活化的荧光素与组织蛋白中酪氨酸残基发生共价偶联；

4. 微波处理洗除非共价结合的抗体，共价结合的荧光素稳定保留；

5. 通过多轮标记循环，可在同一组织切片上实现多种靶标的同时标记。

（三）技术优势

1. 结果可直接作为临床报告使用：

多重荧光染色二抗试剂盒及全自动免疫组化染色机等全线产品已获医疗器械认证。染色图像和定量分析结果可直接作为临床报告依据，满足从科研探索到临床检测的无缝衔接，为伴随诊断开发和新药临床试验病人筛选提供合规化工具。

2. 一张切片，多重靶标：

一张切片可实现1-8个蛋白靶标标记，配合核染达到9色成像，高效节约珍稀样本，精准获取细胞表型与空间分布信息。

3. 抗体选择零限制：

由于每轮仅使用单一抗体孵育，完全无需考虑多抗间的交叉反应及一抗二抗的种属匹配问题，所有靶标均可使用同一来源（鼠/兔）抗体，实验设计极为简便。

4. 全自动流程+智能分析：

支持全片全景扫描，图像永久保存；通量可达80片/批次，人工结合软件算法可实现批量操作。多光谱成像系统配备一键扣除组织自发荧光功能，光谱高精度拆分确保各通道信号无串色干扰。图片呈现色彩丰富，靶标颜色可自由更改，便于学术发表和临床报告的多形式呈现。

（四）可解决哪些科学问题？

多重荧光免疫组化可作为单细胞测序与空间转录组的重要验证手段，在组织原位、蛋白水平和单细胞空间分辨率下，对关键细胞亚群、候选标志物及空间分布特征进行交叉验证，构建“单细胞发现—空间定位—蛋白验证”的多维研究闭环。从而回答：

如何在有限组织样本中，同时获得多种蛋白及其空间分布信息？

单细胞测序发现的关键细胞亚群是否能够在组织中被原位验证？

空间转录组发现的空间表达模式，是否能够在蛋白水平得到验证？

如何筛选具有转化潜力的关键标志物？

生命科学研究正在从传统的“群体平均”分析，迈向更高分辨率、更具空间维度的精准解析。依托高通量测序与多组学技术平台，云序生物围绕不同研究目标、样本类型及应用场景，构建了覆盖单细胞转录组、单细胞表观组、空间转录组及原位蛋白验证的综合技术体系：

从单细胞发现、机制解析，到空间定位，再到原位验证——云序生物以多组学技术连接细胞、分子与组织，为生命科学研究提供更全面、更深入的解析方案。