BACS的开发

Ψ与尿苷的关键区别在于游离N可发生Michael加成。研究团队设想引入α-卤素基团可触发分子内O2-烷基化，最终导致Ψ-to-C突变（图1a）。研究团队在含Ψ的10-mer寡核苷酸上测试2-溴丙烯酰胺，MALDI质谱分析显示质量增加69 Da，形成环化产物nce1，2Ψ（图1a,b）。对含有两个Ψ位点的72-mer RNA进行测试，经RT与NGS后，U-to-C突变率达86.6%，而U-to-R（R=A或G）低于1%，确认U-to-C突变率可作为转换率（图1c）。使用含有NNΨNN和NNUNN基序的30-mer RNA spike-in评估序列偏好性，BACS显示出87.6%的Ψ转化率和仅0.75%的尿嘧啶假阳性率，几乎所有256个基序转换率>80%，多数>85%，仅少数基序假阳性略高（3–4%），整体显著优于BID-seq（图1c）。通过混合不同比例的spike-in，研究团队生成了实现Ψ准确定量的线性校准曲线（R²=1.00）（图1d）。

BACS在人类rRNA上的验证

研究团队将BACS应用于HeLa和C666-1细胞的细胞质rRNA（cy-rRNA），仅在Ψ位点观察到高突变率，其他碱基突变极低（图2a,b）。以5%修饰水平为阈值，在5.8S、18S和28S rRNA中分别检测到2、40和62个Ψ位点，多数修饰水平>80%（图2c-e）。与报道的SILNAS质谱（SILNAS MS）数据相比，人类细胞质rRNA中已知的105个Ψ位点中有103个（包括一个2'-O-甲基假尿嘧啶Ψm位点）被高置信度鉴定（图2c-e）。然而，18S rRNA中的Ψ1136未被检测到，这可能是因为其在HeLa细胞中的修饰水平较低（BACS检测为4.5%）。与BID-seq一致的是，研究团队在对照库中检测到已知的18S rRNA Ψ36位点有16%的Ψ-to-C突变率，但在BACS处理后，突变率增加到80%（图2d），表明HeLa细胞中存在未表征的SNP位点。因此，BACS能够高置信度检测人类细胞质rRNA中绝大多数已知Ψ位点，并对低修饰水平位点和潜在序列变异提供有效解析（图2f）。研究团队也对线粒体rRNA（mt-rRNA）进行了BACS检测，并在12S和16S rRNA中分别检测到8个和1个Ψ位点，修饰水平整体低于cy-rRNA（图2b）。

BACS鉴定人类snRNA中密集的Ψ位点

研究团队将BACS应用于四种细胞系的剪接体snRNA。BACS检测到了人类主要snRNA中所有已知的Ψ位点（图2h），比如HeLa细胞主要snRNA（U1, U2, U4, U5, U6）中的Ψ位点（图2g）。重要的是，BACS成功检测到人类U2 snRNA中所有14个Ψ位点，表明BACS在检测密集和连续Ψ位点方面的优越性（图2i）。

人类snoRNA的Ψ图谱此前研究较少。相比Ψ-seq和BID-seq仅检测到11和39个位点，BACS在HeLa细胞snoRNA中检测到304个Ψ位点，其中box C/D snoRNA、box H/ACA snoRNA和scaRNA分别为205、67和32个（附图5a–c）。研究团队观察到box C/D snoRNA中Ψ位点富集于box D'上游和box C'下游区域，box H/ACA snoRNA中Ψ位点富集于box H和ACA上游区域，暗示Ψ可能在介导snoRNA与其靶标相互作用中发挥作用。此外，在端粒酶RNA组分（TERC）中检测到7个Ψ位点，其中3个为新位点，均位于TERC核心结构域（附图5f）。

人类tRNA的全面Ψ图谱

研究团队用BACS生成了HeLa细胞cy-tRNA的定量Ψ图谱，共609个高置信度Ψ位点。每个tRNA的Ψ位点数量在不同同工受体间存在差异（图3a），且主要位于高度保守的位置（如13, 27-28, 38-40, 55位）（图3b）。其中第55位是最频繁且修饰程度最高的Ψ位点，第13位也呈高修饰水平（图3c）。

研究团队还在线粒体tRNA（mt-tRNA）中检测到54个Ψ位点（图3a），结合四种细胞系结果共鉴定65个Ψ位点，与已发表数据集高度一致（图3d）。总体而言，人类mt-tRNA的假尿嘧啶化程度低于cy-tRNA。相比之下，PRAISE在mt-tRNA中仅检测到34个位点，且在连续Ψ位点定量和单个Ψ位点精确定位方面存在困难，最终仅对13个位点实现定量和单碱基分辨率检测。

HeLa mRNA中Ψ的分析与定量

研究团队进一步利用BACS检测HeLa mRNA中的Ψ修饰，共检测到1,335个Ψ位点（图4a），其中大部分修饰水平较低（<20%）（图4a,b）。mRNA和ncRNA中分别检测到1,294个和41个位点（图4c），富集在CDS和3' UTR（图4c,d）。这些位点分布于1,103个转录本，多数仅携带一个Ψ位点（图4e）。序列分析显示，55.3%的Ψ位点位于连续尿苷序列中。Ψ主要富集于USΨAG和GUΨCN基序，分别对应PUS7和TRUB1基序（图4f），其中GUΨCN基序修饰水平相对较高（图4g）。与已发表数据集比较，BACS准确鉴定出CMC方法"最高置信度"类别中70个位点的61个（87.1%）。与BID-seq和PRAISE的重叠度分别为40.0%和32.6%，且这些方法独有的位点在BACS数据集中多呈低修饰水平。

A-to-I编辑位点和m1A的同步检测

BACS揭示HeLa细胞中新的PUS靶点

研究团队构建了TRUB1、PUS7和PUS1三种关键PUS酶的敲除细胞系（图5a）。

与TRUB1是cy-tRNA Ψ55唯一合成酶的传统观点相反，敲除TRUB1并未完全消除cy-tRNA的Ψ55，提示存在PUS酶的功能冗余（图5b,c）。而所有mt-tRNA的Ψ55在TRUB1敲除后完全消失，挑战了TRUB2专门负责mt-tRNA Ψ55的观点。研究团队进一步发现TRUB1基序可从GUΨCNA扩展至GUΨNNA（图5d）。

PUS7敲除揭示其除已知靶点Ψ13和Ψ35外，还负责cy-tRNA中Ψ20B、Ψ36和Ψ50的形成（图5e），并发现其在线粒体中催化mt-tRNAMet的Ψ50（图5f）。研究团队将PUS7共识基序修正为更宽松的UNΨAR和UGΨKG（图5g）。

PUS1敲除导致cy-tRNA中Ψ27/28完全丢失，在mt-tRNA中PUS1还催化Ψ27/28和Ψ66/67/68的形成（图5h），并催化mt-mRNA中鉴定的全部7个Ψ位点（图5i），表明PUS1是线粒体中功能多样的主要PUS酶。PUS1依赖的Ψ位点无序列基序，符合其活性依赖RNA结构的报道（图5j）。研究还发现TRUB1、PUS7和PUS1在poly(A)+ RNA中的靶点修饰程度远低于tRNA中的对应位点，提示mRNA可能并非这些独立PUS酶的主要底物。

病毒RNA中Ψ的图谱绘制

研究团队将BACS应用于五种RNA病毒（SARS-CoV-2、HCV、ZIKV、HDV和SINV）。然而在这五种病毒中均未检测到高置信度的Ψ位点（图6a），尽管已确认病毒感染稳健、病毒RNA丰度和覆盖深度均较高。这表明在所检测的RNA病毒基因组或转录本中，Ψ可能并非普遍存在的RNA修饰形式。对于DNA病毒EB病毒（EBV），此前研究报道EBER2中存在一个低修饰的Ψ160位点。然而，研究团队检测到EBER2中一个高修饰的Ψ114位点，而EBER1中未发现Ψ位点（图6b,c）。该Ψ114位点在所有检测的EBV毒株和宿主细胞系中均保守。研究团队通过改良的BID-seq验证了该位点，但BS方法因缺失信号的局限无法确定其确切位置，进一步凸显了BACS的优势。

产品一：BACS-Seq

BACS基于2-溴丙烯酰胺的Michael加成诱导环化策略，在Ψ的游离N1和O2间形成分子内环化产物，进而在逆转录过程中特异性转换为C碱基，产生可被高通量测序捕获的Ψ-to-C突变指纹。BACS突破了序列背景依赖、定量精度和检测灵敏度等瓶颈，在修饰捕获效率与信号转化率方面进一步优化，更适用tRNA、snRNA等结构复杂的RNA，以及rRNA、snoRNA等Ψ修饰高度密集的RNA，使大规模转录组Ψ图谱的构建成为可能。

产品二：BID-Seq

用于假尿嘧啶修饰的高通量检测与单碱基分辨率定位。该技术利用BS诱导反应，将Ψ位点特异性转化为“Ψ-BS加合物”，进而导致逆转录过程中该位点产生明确的碱基缺失信号。通过建库测序与专用数据分析流程，BID-seq可实现对Ψ修饰的精准定量与单碱基定位。

产品三：Ψ-RIP-Seq

用于全面检测多种RNA分子上的假尿嘧啶（Ψ）修饰水平。该服务基于特异性抗体富集策略：使用Ψ抗体捕获带有修饰的RNA片段，结合高通量测序，并辅以Input对照样本去除背景干扰。最终通过对比IP与Input样本的序列信息，实现Ψ修饰区域的转录组定位及修饰程度的精准评估。

优势一：RNA修饰产品线齐全，热门修饰IP类/单碱基分辨测序 + IP试剂盒

优势二：300+篇SCI论文、数千例测序样本

优势三：MeRIP-seq全面升级，spike in严格质控IP实验

优势四：测序到验证、靶标定位到分子机制，云序提供一站式服务

RNA修饰测序是云序生物转录调控及表观组学旗下的重磅产品。在国内，目前云序生物具有全面的RNA修饰测序平台。云序累计助力客户发表300+篇RNA修饰SCI论文，影响因子2000+，累计完成数千例RNA甲基化测序样本，全面覆盖医口、农口等各类样本。文章涉及多种组学联合方案提供RNA修饰一站式服务，包括上游整体修饰水平的检测、RNA修饰高通量测序、测序后的验证实验，还提供“各类分子互作组研究”服务，助力探究深层分子作用机制！