糖基化RNA（GlycoRNA）：

一类同时携带糖链和RNA修饰的细胞表面分子，正从基础发现走向疾病诊断与治疗应用

不止蛋白脂质，RNA也能发生糖基化修饰

在GlycoRNA被发现前，学界普遍认为糖基化是蛋白、脂质的专属修饰方式，糖生物学与RNA生物学的研究长期相互独立。2021年的突破性研究首次证实：哺乳动物体内的非编码小RNA（tRNA、Y RNA、snRNA等）可发生共价糖基化修饰，形成稳定的GlycoRNA复合物。

与传统RNA截然不同，GlycoRNA具备显著不同的独特结构和功能特征：

• 结构特殊性：由RNA骨架+共价结合的聚糖链构成杂合结构，主要分为N-连接、O-连接两种糖基化类型，结构存在显著的细胞、组织特异性；

• 定位特殊性：传统RNA主要定位于细胞内，而大量GlycoRNA会转运至细胞膜表面，还可富集于细胞外囊泡（sEVs）；

• 功能特殊性：同时兼具核酸杂交特性与作为聚糖结合蛋白配体功能，可介导细胞间通讯、免疫识别，填补了转录组与糖组学之间的研究空白。

更重要的是，体液中稳定存在、囊泡包裹保护的特性，让GlycoRNA完美规避了RNA易降解的短板，具备成为无创液体活检标志物的先天优势。然而，糖RNA的研究仍然受到其相对低丰度以及从细胞糖蛋白和非糖基化RNA的复杂背景中区分它们所面临的分析挑战的制约。

结构与功能：精准解析GlycoRNA的分子特征与生理机制

糖RNA是具有显著结构异质性的RNA-聚糖结合物，与典型的RNA或糖蛋白不同，糖RNA将RNA骨架与共价连接的聚糖整合在一起。GlycoRNA的结构异质性是其功能多样性的核心基础，两类核心组分分工明确、相互协同（Fig. 2）：

① 聚糖基团：不同的聚糖可能具有不同的化学基团和分子结构，从而赋予母体RNA分子不同的物理化学性质，主要由N-乙酰己糖胺、岩藻糖、唾液酸等核心单元组成。依据共价连接方式可划分为N-连接聚糖与O-连接聚糖两大类（Fig.2B）。

N-聚糖结构复杂度更高，可形成二分、三分甚至四分支的高度分支结构，分子量跨度大、结构亚型丰富；庞大的聚糖链共价连接到RNA支架上，可能靶向带有胺基的修饰核碱基，如acp3U，它模拟了N-糖基化所需的天冬酰胺保守序列（图2A）。Flynn等人通过整合质谱和测序分析，确定acp3U（在特定tRNA和其他小RNA中富集）是N-连接聚糖的主要附着位点。这种位点特异性修饰很重要，因为它可以空间位阻地屏蔽acp3U基序，并且聚糖链可能阻断先天免疫传感器（如TLR3和TLR7）对RNA的识别，从而防止自身免疫激活并介导免疫逃逸。

O-聚糖的主要特征为O-GalNAc核心，以Core-1和Core-2结构为主。这些O-聚糖在不同细胞系中也显示出异质性。值得注意的是，这些链通常带有独特的末端修饰。但是将这些O-聚糖连接到RNA分子的精确化学键仍然是该领域一个根本性的未解问题，这使其有别于蛋白质O-GalNAc化中明确的肽-N-乙酰半乳糖胺连接。

GlycoRNA的糖基化修饰具有极强的细胞与组织特异性，不同细胞系、正常组织与肿瘤病灶的聚糖分支、岩藻糖基化、唾液酸化水平存在明显差异，可形成独一无二的“糖基化分子指纹”，为疾病分型、特异性识别提供了重要依据。与此同时，聚糖链末端富集的唾液酸、岩藻糖残基可作为特异性配体，精准结合细胞膜表面Siglec家族、P-选择素等免疫调控受体，直接介导细胞间黏附、免疫识别与炎症信号激活，是GlycoRNA参与免疫稳态调控与疾病病理进程的关键功能结构。

② RNA骨架：在早期研究中，受富集技术与测序手段的限制，学界普遍认为GlycoRNA仅修饰200 nt以内的小非编码RNA，主要包括tRNA、Y RNA、snRNA、snoRNA等经典亚型（图2C）。随着转录组水平糖基化测序技术的不断成熟，越来越多研究证实，GlycoRNA的RNA骨架具有更广的分子多样性，存在大量长度超过200 nt的长链RNA亚型，极大拓展了GlycoRNA的分子类型。RNA骨架的一级序列特征是调控GlycoRNA胞内命运的核心因素。特异性AU富集基序、特征性转录本序列，能够招募SF1、MBNL1等系列RNA结合蛋白，精准介导GlycoRNA的胞内转运、膜定位与细胞外囊泡富集，决定其在细胞通讯中的功能定位。

Fig.2.糖RNA结构特征、糖链类型和代表性RNA类别的概览

GlycoRNA的生成依托经典的分泌糖基化系统，且两类糖基化RNA的合成通路存在显著差异（Fig. 3）

N-连接GlycoRNA：起始于细胞核或细胞质，其中特定的sncRNA（如tRNA）经历由DTW结构域包含蛋白2催化的转录后修饰在胞内完成RNA碱基修饰，经SIDT1/2转运进入内质网，再通过高尔基体完成糖链成熟修饰，最终定位细胞膜或囊泡（Fig.3B）；

O-连接GlycoRNA：主要在高尔基体完成糖基化组装，与蛋白质的粘蛋白型O-糖基化平行。一旦进入高尔基体，O-聚糖的起始被认为涉及多肽N-乙酰半乳糖胺转移酶家族，将GalNAc残基安装到RNA上形成“RNA-GalNAc”中间体。随后由C1GALT1/COSMC延伸，GCNT1分支，以及ST3GAL/ST6GAL唾液酸转移酶加帽，可以生成Core-1/Core-2结构，目前其精准连接机制仍待进一步验证。

Fig.3细胞表面唾液糖RNA的生物合成通路

GlycoRNA最明确的生物学功能是作为细胞表面的免疫调节分子，且在疾病中发生显著异常，参与多重病理调控通路（Fig. 4）：

免疫稳态调控：细胞膜表面GlycoRNA可通过聚糖结构结合Siglec、P-选择素等免疫受体，介导免疫识别、白细胞黏附；同时糖链可屏蔽RNA免疫基序，避免自身免疫激活，维持免疫耐受；

疾病病理调控：在癌症、自身免疫病、炎症性疾病中，GlycoRNA的表达量、糖基化模式会发生特异性紊乱。肿瘤中高表达的GlycoRNA可构建免疫抑制微环境，促进肿瘤增殖；系统性红斑狼疮中糖链缺失会暴露RNA免疫位点，诱发慢性炎症；

囊泡信号传导：sEVs携带的GlycoRNA可作为循环信号分子，调控受体细胞的吞噬、炎症反应与血管生成，是细胞远程通讯的重要载体。

糖RNA的分离与富集方法

GlycoRNA的研究面临两大技术挑战：相对于总RNA丰度极低，以及糖蛋白和非糖基化RNA等背景组分的严重干扰。针对这些问题，研究者已开发多种富集策略（Fig.5）。

凝集素亲和富集（Fig.5D）：利用小麦胚芽凝集素(WGA)对GlcNAc和唾液酸的高亲和力，从总RNA中富集glycoRNA。该方法操作简便，是早期glycoRNA研究的核心手段，但灵敏度和特异性有限，且需要较高的起始样品量。

通过Ac4ManNAz等代谢化学报告分子孵育细胞，使细胞将含叠氮基团的糖类似物掺入glycoRNA，再经无铜点击化学进行检测和富集（Fig.5A）。该策略在2021年glycoRNA的首次发现中发挥了关键作用，该方法的一个关键优势在于其严格的验证能力。该方案需要严格的对照以确认观察到的信号是特异的。它局限于代谢活跃的系统，不适用于静态的临床标本或存档组织。此外，代谢掺入效率可能较低，所需的延长孵育时间可能引入细胞毒性。这些挑战凸显了对能够分析临床或非活性样本的其他技术的需求。

• 化学酶法标记——rPAL（Fig.5B）：利用高碘酸钠将唾液酸末端的邻二醇氧化为醛基，再与生物素探针连接实现捕获。该方法不依赖活细胞代谢，适用于临床组织样本，但氧化条件可能对RNA造成一定损伤。

• 化学酶法标记——StCEL（Fig.5C）：借助唾液酸转移酶将叠氮标记的唾液酸直接转移至天然glycoRNA，避免强氧化剂的使用，反应条件相对温和。

• 固相捕获策略——SPCgRNA：针对N-连接glycoRNA的“双选择”富集方案——先经半乳糖氧化酶产生醛基实现共价固相捕获，再以PNGase F酶特异性释放N-连接glycoRNA，可鉴定肿瘤特异性糖基化miRNA等新型靶点，广泛应用于胰腺癌等肿瘤研究。

• 固相捕获策略——TnORNA：针对O-连接glycoRNA（特别是携带Tn抗原者）的化学酶法富集方案，利用O-糖苷酶特异性释放目标分子，用于O-糖基化RNA的解析。

富集后的GlycoRNA可通过高通量测序解析RNA序列，结合质谱技术鉴定糖链结构、修饰位点，搭配GlycoRNAdb等专属数据库，实现从分子鉴定、结构解析到功能注释的全流程分析。RNA N/O-糖质谱分析用于解析糖链组成和连接位点；在测序方面，转录本鉴定需要将结构化的、高度修饰的小RNA转化为可扩增的文库，GlycoRNA Pandora-Seq：对糖基化小RNA进行定性和定量检测，全面涵盖rsRNA，tsRNA，Y RNA，miRNA，piRNA等各种小RNA。Long GlycoRNA-Seq：对200nt以上的长链糖基化RNA进行定性和定量检测，全面涵盖mRNA、LncRNA等各类长链RNA；两者构成glycoRNA结构鉴定的核心工具。

Fig.5糖RNA的分离与富集方法

Fig.6糖RNA的成像与检测技术

细胞外囊泡GlycoRNA的临床检测进展

细胞外囊泡(sEV)表面的glycoRNA具有液体活检标志物的开发潜力，但其检测面临丰度低、尺度小和基质复杂等分析挑战。目前该方向已发展出多种基于双识别逻辑（同时识别糖链和RNA）的检测平台：

• drFRET（双识别FRET平台） ：采用唾液酸适配体（供体）和RNA探针（受体），当两者在同一glycoRNA分子上空间邻近时产生FRET信号。该平台无需酶促扩增，操作简便快速。在一项包含88例癌症患者和12例对照的临床队列中，该检测区分癌症与非癌症的AUC达到1.0，且基于5个glycoRNA的组合可实现多癌种分类，总体准确率约为89%。

• PREDICTOR（邻近编码非线性杂交链式反应电路） ：在双识别基础上耦合无酶催化DNA自组装级联放大反应，适用于低丰度glycoRNA的原位定量分析，并可进一步用于研究glycoRNA丰度与囊泡异质性及细胞摄取效率的关联。

• PO-OL/MB结合dSTORM：采用高碘酸氧化-肟连接进行糖链化学标记，分子信标识别RNA靶标，结合超分辨显微成像(dSTORM)，实现单个囊泡表面glycoRNA的纳米级共定位成像，是空间分布验证的有效工具。

上述技术各有侧重：drFRET侧重于检测速度与临床转化适配性，PREDICTOR侧重于低丰度靶标的信号放大，PO-OL/MB则侧重于空间分辨验证。目前这些平台仍需大规模多中心临床验证，且主要针对表面暴露的glycoRNA，囊泡腔内glycoRNA的检测仍面临技术困难。

方法学考量与实验对照设计

挑战与未来展望

GlycoRNA领域的发展面临以下关键问题与方向（Fig.7）：

标准化与绝对定量（Fig.7A）：不同实验室采用rPAL、代谢标记等不同富集方法，结果之间的可比性受到限制。合成glycoRNA标准品（已知结构和浓度）的建立将有助于仪器校准和绝对定量，是推动glycoRNA从基础研究走向临床检测的关键基础支撑。

临床检测转化（Fig.7B）：现有研究级平台（共聚焦显微镜、质谱仪、高通量测序）需向即时检测(POCT)格式转化，如侧向层析试纸条或微流控芯片，同时保持双识别逻辑所赋予的特异性。大规模多中心临床验证以及干扰因素（年龄、炎症状态、合并症等）的系统评估不可或缺。

AI驱动的数据整合（Fig.7C）：GlycoRNA涵盖RNA序列/修饰和糖链组成两个维度的信息，数据复杂性较高。AI可应用于：(1) 质谱谱图中糖-核苷碎片的解析；(2) 测序数据中真正glycoRNA富集序列与氧化/点击化学假阳性信号的区分；(3) glycoRNA panel与蛋白组、代谢组、临床变量的多模态整合，构建诊断和预后模型。上述应用的前提是高质量、标准化的共享数据资源的建立。

治疗应用前景：GlycoRNA还可能作为新型治疗干预靶点——干预glycoRNA与Siglec受体的相互作用、靶向生物合成通路关键酶（DTWD2、OST等）、或设计glycoRNA模拟物作为靶向递送载体。这些方向代表了RNA治疗与糖科学交叉的潜在应用空间。

Fig.7糖RNA的挑战与未来展望

优势一：RNA修饰产品线齐全，热门修饰IP类/单碱基分辨测序 + IP试剂盒

优势二：300+篇SCI论文、数千例测序样本

优势三：MeRIP-seq全面升级，spike in严格质控IP实验

优势四：测序到验证、靶标定位到分子机制，云序提供一站式服务

RNA修饰测序是云序生物转录调控及表观组学旗下的重磅产品。在国内，目前云序生物具有全面的RNA修饰测序平台。云序累计助力客户发表300+篇RNA修饰SCI论文，影响因子2000+，累计完成数千例RNA甲基化测序样本，全面覆盖医口、农口等各类样本。文章涉及多种组学联合方案提供RNA修饰一站式服务，包括上游整体修饰水平的检测、RNA修饰高通量测序、测序后的验证实验，还提供“各类分子互作组研究”服务，助力探究深层分子作用机制！