TRMT10C促进成骨细胞分化，并在骨质疏松症中下调

Trmt10c mRNA在12周龄野生型（WT）小鼠的颅骨和长骨中呈高表达（图1a）。对全细胞裂解液和线粒体裂解液的分析表明，在BMSCs成骨分化过程中，TRMT10C蛋白水平升高（图1a–f）。与上述发现一致，免疫组织化学（IHC）和免疫荧光（IF）染色显示，卵巢摘除（OVX）模型小鼠和老年小鼠的小梁骨表面TRMT10C阳性成骨细胞显著减少（图1g–n）。进一步分析表明，骨质疏松症患者来源的BMSCs中TRMT10C表达水平显著低于健康对照组（图1o–p）。

功能实验结果显示，TRMT10C过表达可增强成骨分化，而TRMT10C敲低则显著抑制该过程。这些效应通过碱性磷酸酶（ALP）染色、茜素红染色以及关键成骨标志物（包括Runx2、osterix（OSX）、ALP和骨钙素（OCN））的蛋白质印迹（Western blotting）分析得以证实（补充图2a–j）。总之，这些数据表明TRMT10C与成骨细胞功能及骨质疏松进展呈正相关。

TRMT10C催化mt-rRNA/tRNA的m1A修饰

eCLIP-Seq结果显示，TRMT10C能够结合mt-rRNA、mt-tRNA和mt-mRNA（图2a–e）。对三个BMSC样本的分析鉴定出123个与TRMT10C存在共同相互作用的基因（图2b, c），其中包括2个mt-rRNA（4个峰）和6个mt-tRNA（16个峰）（图2d）。基因组定位表明，mt-rRNA含有TRMT10C结合区域（图2e）。鉴于mt-mRNA大多缺乏UTR序列，且其编码序列上的m1A修饰会抑制转录后翻译过程；同时，TRMT10C突变细胞中OXPHOS亚基表达水平降低。因此，TRMT10C促进OXPHOS亚基表达的作用并不依赖于对mt-mRNA的m1A甲基化修饰。

为了全面表征TRMT10C敲低后的m1A甲基化修饰谱，研究采用m1A MAP-Seq技术来分析线粒体RNA种类的修饰情况。值得注意的是，虽然mt-tRNA上的m1A甲基化水平保持显著稳定，但mt-rRNA内部有多位点的m1A修饰发生了显著变化（图2f，g）。鉴于TRMT10C具有甲基转移酶活性，研究将eCLIP结合图谱与m1A-MAP数据整合，以鉴定出既与TRMT10C结合又呈现m1A修饰降低的位点。TRMT10C敲低导致24个mt-rRNA位点的m1A修饰下调；其中，ChrM:1882、ChrM:1862和ChrM:1895等位点的变化尤为显著（图2g）。这些特异性位点此前未见报道。上述结果表明，骨髓间充质干细胞（BMSCs）中TRMT10C的缺失主要调节线粒体核糖体RNA上的m1A修饰，可能由此干扰线粒体翻译机器及下游细胞过程。

本研究证明，TRMT10C除已知的催化mt-tRNA和mt-mRNA的m1A修饰功能外，还能结合并催化mt-rRNA的m1A修饰。

骨祖细胞中Trmt10c缺失导致生长迟缓和骨质流失

为明确TRMT10C在体内成骨细胞中调控骨稳态的作用，研究构建了骨祖细胞特异性敲除Trmt10c的小鼠模型（Osx-Cre; Trmt10cfl/fl，以下简称Trmt10c cKO），并证实BMSCs中TRMT10C成功敲除（补充图6a, b）。这些BMSCs表现出显著的增殖能力降低，具体表现为生长速率减慢、PCNA/Ki67表达下降以及EdU掺入减少（补充图6c–g）。

Trmt10c cKO小鼠呈现生长迟缓、牙齿异常和多发性骨折（图3a–c，补充图6h–l），同时骨强度显著降低（补充图7a–c）。研究评估了Trmt10c cKO小鼠骨形成的改变。Trmt10c cKO小鼠来源的BMSCs成骨分化能力下调（补充图7d–f）。ELISA分析证实，Trmt10c cKO小鼠血清中骨形成标志物PINP水平降低（补充图7g）。μCT分析显示，Trmt10c cKO小鼠胫骨远干骺端的松质骨和皮质骨骨量以及骨矿物密度均显著减少（图3d–l）。

组织学染色显示，Trmt10c cKO小鼠成骨细胞数量减少，而脂肪细胞数量和面积均增加（补充图7h–j，图3m–q）。此外，Trmt10c cKO小鼠的动态骨组织形态计量学参数，包括矿物质沉积率（MAR）、矿化表面与骨表面比值（MS/BS）以及骨形成率与骨表面比值（BFR/BS）均显著降低（补充图7k–o）。

研究还评估了Trmt10c cKO小鼠骨吸收的改变。Trmt10c cKO小鼠骨髓细胞中的破骨细胞分化减弱，表现为TRAP染色以及破骨细胞分化因子（包括活化T细胞核因子1（NFATc1）、组织蛋白酶K（CTSK）和TRAP）表达水平的降低（补充图8a–d）。ELISA检测显示，Trmt10c cKO小鼠血清中骨吸收标志物CTX1和ACP5水平下降（补充图8e, f）。组织学TRAP染色显示，Trmt10c cKO小鼠破骨细胞数量显著减少（补充图8g–i）。此外，BMSCs中RANKL和OPG蛋白的表达均降低，且RANKL/OPG比值显著下降（补充图8j–l）。

为发现新型TRMT10C激动剂，研究采用了基于结构的虚拟筛选策略。首先利用PASSer服务器系统预测了多个TRMT10C结构中的潜在别构位点，包括冷冻电镜结构（PDB: 7ONU）、晶体结构（PDB: 5NFJ）以及AlphaFold预测的全长模型。在排除经典底物（SAM）结合位点后，鉴定并筛选出四个高置信度的候选别构口袋用于后续研究（图4a）。

随后，针对排名靠前的别构口袋开展了多阶段虚拟筛选。利用Schrödinger套件中的Glide模块，对超过100万个商业化合物组成的文库进行了依次筛选。排名前100的化合物，进一步采用MM/GBSA方法计算其结合自由能进行精筛。最终，根据MM/GBSA评分和结构多样性，并经过人工审核，优先选出30个候选化合物用于实验验证（图4b）。

接下来，将30个候选化合物分别处理BMSCs。基于CYTB（一种关键的线粒体编码OXPHOS亚基）蛋白表达水平的初步评估，筛选出六个初始阳性化合物，包括TM1、TM3、TM6、TM9、TM15和TM24（补充图9a）。

这六个候选化合物在BMSCs中进一步评估其上调更广泛的线粒体基因组编码OXPHOS亚基（包括ND1-ND6、CYTB、COX1-COX3、ATP6和ATP8）的能力。在第二轮筛选中，化合物TM3被确定为最有效的OXPHOS亚基表达诱导剂（补充图9b）。剂量反应实验证实，10 nM是TM3促进BMSCs中OXPHOS亚基表达的最佳浓度（图4c，补充图9c）。

为确认TM3通过直接与TRMT10C相互作用发挥其效应，研究进行了细胞热迁移分析（CETSA）和表面等离子体共振（SPR）实验。CETSA结果表明，TM3处理可显著稳定BMSCs中的TRMT10C蛋白以抵抗热变性，表明其直接靶向细胞内靶标（图4d）。使用纯化的重组TRMT10C蛋白进行的SPR光谱分析进一步验证了这种相互作用，显示其直接结合的解离常数（Kd）为2.6 μM（图4e）。

接下来，研究系统评估了激动剂TM3的体内安全性和药代动力学特征。对8周龄野生型小鼠腹腔注射TM3后，小鼠体重、肝功能指标（ALT和AST）、肾功能指标（UREA和CRE-BD）均无显著变化，主要器官的组织病理学检查（H&E染色）亦未见异常（补充图10a–e）。

TM3在C57BL/6J小鼠中即使剂量高达100 mg/kg/天也未表现出急性毒性（补充图11a）。所有小鼠在为期3天的治疗期内全部存活，存活率为100%，且未观察到明显的毒性迹象（补充图11b）。整个研究期间小鼠体重保持稳定（补充图11c–e）。生化分析显示肝酶未升高，TM3处理组与溶剂对照组的ALT/GPT和AST/GOT活性相当（补充图11f, g）。此外，全面的血液学评估表明，TM3不影响任何血细胞参数，所有参数均在正常范围内（补充图11h–s）。这些结果表明，TM3在测试剂量下具有良好的急性耐受性，无肝毒性或血液毒性。

为建立具有最佳治疗窗的给药方案，研究首先在2mg/kg的探索性剂量下评估了TM3的药代动力学特征。证实了其良好的类药物特性，包括较长的血浆半衰期（T_1/2 = 1.53h）和较高的全身暴露量（C_max = 7.3 μM）（补充图10g–h）。为优先确保较宽的安全范围并在保留疗效的同时最大限度减少潜在的脱靶效应，在后续治疗研究中选择了显著更低的剂量——50 μg/kg（补充图10i, j）。在该有效剂量下的药代动力学分析显示，C_max为0.19 μM（约44.6 ng/mL），相较于体外EC₅₀（10 nM）提供了约19倍的暴露边界。

TRMT10C激动剂促进成骨细胞分化并预防骨质疏松症

随后，为确定TRMT10C激动剂TM3能否减轻衰老和卵巢切除引起的骨质流失。体外功能实验证实，TM3处理可显著增强小鼠BMSCs的成骨分化，表现为ALP染色、茜素红染色及关键成骨标志物（包括Runx2、Osx、ALP和OCN）蛋白水平升高（补充图12a–c）。然而，TM3未能促进来源于Osx-Cre;Trmt10cfl/fl小鼠的BMSCs的成骨分化（补充图12d–f）。此外，TM3处理还能增强人BMSCs的成骨分化（补充图12g–i）。

为评估其体内疗效，研究使用OVX诱导的骨质疏松模型。将12周龄C57BL/6野生型雌性小鼠腹腔注射TM3或溶剂对照（50 μg/kg/天），持续8周，TM3处理对体重无显著影响（图5a）。TM3给药显著提高了骨组织中m1A和OXPHOS亚基的水平（图5b, c）。胫骨近端的μCT分析显示，TM3处理显著增加了假手术组和OVX组小鼠的松质骨骨量和骨矿物密度（图5d–l）。

ELISA血清生物标志物分析显示，TM3处理显著提高了假手术组和OVX组小鼠的骨形成标志物PINP以及骨吸收标志物CTX-1和ACP5的水平（补充图13a–c）。与改善的骨微结构一致，组织学染色显示TM3处理的假手术组和OVX组小鼠成骨细胞和破骨细胞数量增加，同时脂肪细胞数量和面积减少（补充图13d–g，图5m–o）。此外，TM3处理显著提高了假手术组和OVX组小鼠的动态骨组织形态计量学参数（补充图13h–l）。

研究进一步评估了TM3在年龄相关性骨质疏松模型中的治疗潜力。将12月龄雄性C57BL/6小鼠给予溶剂对照或TM3（50 μg/kg/天，腹腔注射）处理10周，与对照组相比，TM3处理组小鼠体重减轻（补充图14a）。TM3给药显著提高了骨组织中m1A和OXPHOS亚基的表达水平（补充图14b, c）。TM3给药显著改善了年龄相关的骨质流失。

μCT和骨组织形态计量学分析证实，TM3处理导致成骨细胞和破骨细胞数量增加，同时骨量和骨矿物密度升高（补充图14d–p）。与此一致，血清分析显示骨形成标志物PINP以及骨吸收标志物CTX-1和ACP5水平均升高（补充图14q–s）。此外，观察到骨髓脂肪显著减少，表现为脂肪细胞数量和面积降低（补充图14t–v）。综合而言，这些结果表明，TRMT10C激动剂TM3在雌激素缺乏和衰老相关的两种小鼠骨质疏松模型中均能有效促进骨形成并防止骨质流失。

• 研究挑战

TRMT10C在骨生物学中功能未知：已知TRMT10C突变会导致线粒体OXPHOS功能障碍和早发性死亡，但其在骨骼系统中的具体作用完全不明确。

骨质疏松与线粒体代谢关联不清：骨质疏松时成骨细胞OXPHOS下调，但上游调控机制及可干预靶点尚未被发现。

靶向TRMT10C的激动剂缺乏：TRMT10C作为潜在治疗靶点尚无已知的小分子激活剂，药物开发存在空白。

• 主要结果

1. TRMT10C在骨质疏松中下调：在年龄相关和雌激素缺乏两种模型中，成骨细胞TRMT10C表达显著降低，且其水平与成骨功能正相关。

2. 新机制发现：TRMT10C不仅催化mt-tRNA和mt-mRNA的m1A修饰，还能结合并催化mt-rRNA的m1A修饰，后者对线粒体核糖体功能和OXPHOS亚基翻译至关重要。其核糖核酸酶P活性和甲基转移酶活性共同调控OXPHOS表达。

3. TRMT10C敲除导致严重骨缺陷：Trmt10c cKO小鼠出现生长迟缓、多发性骨折、骨量显著减少，成骨分化受抑，同时骨吸收也减弱，骨稳态整体受损。

4. 高效激动剂TM3：经虚拟筛选和功能验证获得TM3，其直接结合TRMT10C（Kd = 2.6 μM），在10 nM即可显著提升OXPHOS亚基表达；体内安全性良好，即使剂量高达100 mg/kg/天也无肝毒性或血液毒性。

5. 体内药效显著：在OVX和年老两种骨质疏松模型中，TM3处理均显著增加骨量、骨密度，促进骨形成标志物升高，改善骨微结构，有效对抗骨质流失。

• 总体结论

TRMT10C促进线粒体RNA加工和m1A甲基化，从而增加线粒体基因组编码的OXPHOS亚基的表达并提高OXPHOS活性。该过程促进BMSCs的成骨分化，并发挥抗骨质疏松的作用（图6）。

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