人体内所有体细胞共享一套近乎相同的基因组，却在不同组织中承担着截然不同的功能，呈现出差异化的基因表达模式。这一生命活动的核心调控者，正是转录因子（TF）—— 它们通过结合启动子、增强子等顺式调控元件响应环境信号，精准控制基因的转录开启与关闭，主导细胞分化、发育进程与稳态维持。

长久以来，转录因子结合位点的解析高度依赖 ChIP-Seq、CUT&Tag 等抗体富集类技术，单次实验仅能靶向检测一种已知转录因子，空间分辨率仅数百碱基，既无法一次性绘制全局 TF 调控全景，也难以解析多因子间的协同互作关系。而 ATAC-Seq 等染色质开放区检测技术，仅能间接推断潜在调控区域，无法定位真实的 TF 结合位点。主流常用的 ATAC-Seq、CUT&Tag/ChIP-Seq 各司其职，但都存在无法突破的技术边界。

无论是 ChIP-Seq、CUT&Tag 这类靶向富集技术，还是ATAC-Seq或者足迹检测DNase-Seq 这类开放区检测技术，都依赖百万级细胞的群体样本，只能输出平均化的结合信号，完全无法在单条 DNA 分子层面解析转录因子的真实结合状态。

为突破这一瓶颈，研究者们先后探索了多种单分子足迹技术路径：基于胞嘧啶甲基转移酶 M.CviPI 的单分子足迹法（SMF），却受限于仅能识别 GpC 序列位点，基因组覆盖度严重不足，无法实现全局 TF 检测；另一种 Fiber-Seq 技术依托腺嘌呤甲基转移酶与三代测序平台，虽具备长读长优势，但仅能捕捉强结合转录因子的足迹，且成本高昂、通量有限。

直到2024 年底，北京大学谢晓亮院士团队于在PNAS 发表题为 “Genome-wide single-cell and single-molecule footprinting of transcription factors with deaminase”的研究，基于双链 DNA 胞嘧啶脱氨酶开发出全新 FOODIE（FOOtprinting with DeamInasE）技术，利用转录因子结合产生的空间位阻效应，保护结合区域的胞嘧啶（C）不被脱氨转化为尿嘧啶（U），后续通过高通量测序分析全基因组C-T转化效率的分布特征，实现全基因组范围近单碱基分辨率的 TF 足迹精准检测。FOODIE 兼具低成本与可规模化优势：仅需数千个细胞即可完成全基因组检测，样本起始量远低于 ChIP-Seq 与 DNase-Seq；基因组覆盖度全面超越传统 SMF 技术；同时在检测通量与准确性上，显著优于依赖三代测序的 Fiber-Seq。

研究首先对比了主流双链DNA脱氨酶的性能：初代DddA仅能识别TC碱基序列，只能覆盖极少基因组位点，无法满足全局TF检测需求；团队进一步筛选鉴定出全新脱氨酶DddB，该酶的胞嘧啶脱氨反应几乎不依赖上下游碱基序列，仅存在极微弱的邻近碱基偏差，且可通过裸基因组对照数据精准校正，能够覆盖基因组几乎所有TF结合基序，实现无偏好全基因组扫描（Fig. 1A）。同时研究排除了另一款低偏好酶MGYPDa829，该酶虽序列适配性优异，但存在渐进式脱氨特性，会干扰相邻位点的TF结合信号，无法精准解析TF协同互作，最终确立DddB为FOODIE核心工具酶，保障数据精准度。

在实验流程设计上，FOODIE沿用了ATAC-Seq中Tn5转座酶富集开放染色质的策略，“先Tn5后脱氨酶”，即在渗透细胞中先完成转座反应以保留标记效率，再加入脱氨酶进行胞嘧啶转化；既保障了转座效率，又利用结合在DNA上的TF蛋白物理阻挡脱氨酶靠近，使结合位点下的胞嘧啶免于转化，形成清晰可辨的足迹。同时，通过Tn5预先将测序空间压缩至开放染色质区域，不仅显著降低了测序成本，还实现了高通量分析，且整个流程仅比经典ATAC实验多出一步操作，便于广泛推广（Fig. 1B）。

足迹检测性能验证

为应对组织异质性挑战，研究团队开发了单细胞FOODIE（scFOODIE）。利用开放染色质信号进行无监督聚类，四种混合的人类细胞系（GM12878、K562、HEK293T、HeLa）被清晰区分，且合并同一细胞类型的单细胞数据后，能重现NRF1在特定位点的精确足迹（Fig. 2A）。对小鼠海马约11,200个细胞的scFOODIE分析鉴定出八种主要细胞类型（包括颗粒细胞、锥体细胞、小胶质细胞等），并在海马锥体细胞中观察到AP-1足迹，与该因子在突触可塑性中的已知功能吻合；同时发现SPI1结合仅限于小胶质细胞，凸显了细胞类型特异性的调控特征（Fig. 2B），为解析脑内神经元基因调控的区域和细胞特异性提供了有力工具。

利用FOODIE，研究者进一步探索了相关基因模块（CGM）的调控机制。此前研究表明，同一模块内的基因的协同可能由连续常染色质空间中的TF介导。研究发现多个TF在特定CGM的启动子或增强子中显著富集（Fig. 3C）。更重要的是，三种类型CGM（细胞周期、管家基因、组织特异性）的TF富集模式截然不同：细胞周期和管家基因模块的TF富集主要在启动子，而组织特异性模块则主要在增强子（Fig. 3E），提示存在两种调控模式——基础功能基因依赖启动子TF结合保证稳定性，而组织特异性基因则更多依赖增强子赋予基因表达更强的调控灵活性。尽管仅分配了79个TF，但已揭示出许多先前未知的TF组合来协调基因模块，证实了通过TF组合调控网络的普遍性。

依托单分子测序优势，FOODIE突破群体测序的平均化假象，可精准量化相邻TF的结合协同性。研究全局统计得到3722对显著正向协同TF、55对负向协同TF（Fig. 4D, E）：正向协同源于TF间蛋白互作，呈现“全或无”的结合模式，让基因表达具备阈值敏感性；负向协同源于位点竞争结合，可实现基因双向开关、快速转录切换。正协同的生物学意义类似于血红蛋白的氧合，提供阈上高灵敏度；负协同则兼具双重功能：一是类似λ噬菌体CI-Cro系统的双向基因开关，二是保证TF在浓度振荡时能快速从DNA上解离，从而支持转录的快速切换。完美解释了细胞快速响应外界信号的分子机制，为解析复杂调控网络提供了定量数据支撑。

核心原理：空间位阻介导的精准足迹识别

技术核心逻辑：转座酶Tn5被用于渗透细胞中富集开放染色质区域，然后依托DddB双链DNA脱氨酶，对基因组DNA进行脱氨修饰。基因组中无转录因子结合的游离胞嘧啶（C）会高效转化为尿嘧啶（U）；而被TF特异性结合的DNA区域，因蛋白质产生的空间位阻，会保护胞嘧啶不发生脱氨转化。后续通过高通量测序分析全基因组C-T转化效率的分布特征，即可精准识别单碱基分辨率的TF结合足迹。

• 高分辨率：近单碱基检测精度，可清晰区分相邻转录因子结合边界、识别同一motif上不同位点的结合丰度差异，避免因分辨率不足导致的信号平均化。

• 低样本起始量：仅需数千个细胞即可完成全基因组检测，样本需求量较 ChIP-Seq 降低 2-3 个数量级，适配临床穿刺样本、早期胚胎等稀有样本。

• 无序列偏好性，覆盖绝大多数转录因子：所用脱氨酶序列偏好极低，突破传统单分子足迹技术仅覆盖 GpC 位点的局限，可检测基因组绝大多数转录因子结合基序。

三种技术并非替代关系，而是互补适配不同科研需求，云序小结不同产品选择逻辑：初筛开放区选 ATAC-Seq｜验证已知单TF选 CUT&Tag｜深挖全局精细调控、找新机制选 FOODIE