miCLIP联合GLORI测序鉴定ARE侧翼m6A位点

为研究CD8+T细胞中m6A修饰，该研究采用miCLIP分别对未激活和激活状态的原代人CD8+T细胞进行分析（图1A，图S1A），交联信号显著富集于GGACU等经典RRACH保守序列，同时富集与ARE特征相符的WWAWW基序（图1B）。两类基序均在未激活、激活第1天和第5天的CD8+T细胞样本的miCLIP读段起始处富集（图1B）。鉴于实验所用m6A靶向抗原不含WWAWW序列，该研究推断抗体与ARE序列的结合依赖位点上的m6A修饰。该研究将miCLIP数据中以WWAWW为中心的基序（类ARE基序）命名为miCLIP-ARE位点。进一步解析已发表miCLIP2公共数据集，小鼠胚胎干细胞内GGACU位点的交联信号依赖METTL3表达，UUAUU位点信号受METTL3敲除影响较小（图S1F）。

单碱基m6A测序技术GLORI可精准定量修饰位点。GLORI数据分析表明，m6A修饰峰值富集在RRACH序列，紧邻的WWAWW中心A位点修饰水平显著下降（图S1H）。为在CD8+T细胞中验证上述规律，该研究使用METTL3竞争性抑制剂处理活化CD8+T细胞并开展GLORI-Seq。GLORI检出的m6A位点大量富集在经典miCLIP-RRACH区域（图1C）；约10%定量m6A信号落在miCLIP-ARE位点上下游4个碱基内，信号峰值位于下游2碱基处，WWAWW中心A位点修饰水平偏低，且这类修饰信号依赖METTL3，在静息T细胞中降低最为显著，提示其具有功能作用（图1C）。与随机选取的3'UTR内ARE对照序列相比，GLORI的m6A信号在miCLIP-ARE位点处的富集程度更高；miCLIP-RRACH位点和随机RRACH序列的富集趋势相近，但miCLIP-RRACH位点整体信号更强（图1C）。这些数据表明，miCLIP-ARE位点对应于在“A”中心±4个核苷酸内具有侧翼ARE的经典RRACH基序。

为进一步解析这种基序关系，该研究按照ARE邻近区域RRACH距离远近对miCLIP-ARE位点分组验证，仅周边带有RRACH基序的miCLIP-ARE位点可富集GLORI检出的m6A信号，无邻近RRACH的位点无明显修饰富集（图1D、图S1J）。这些发现揭示了一类对应于RRACH基序且两侧有ARE侧翼的m6A位点——即ARE侧翼m6A位点。

从全基因组分布来看，miCLIP信号集中在终止密码子附近；miCLIP-ARE位点特异性富集于3'UTR起始区域，和全3'UTR均匀分布的ARE Input信号形成对比（图1E）。去除紫外交联不会改变两类基序的基因组分布特征，进一步证明ARE侧翼m6A位点在修饰模式、调控属性上，和经典miCLIP-RRACH型m6A位点分属不同功能亚型。

T细胞活化后含ARE侧翼m6A位点的3'UTR区呈现不稳定性

为解析CD8+T细胞中不同mRNA的调控特征，该研究对miCLIP与RNA-Seq数据按RRACH基序、ARE基序进行分类分析。主成分分析结果显示，miCLIP-RRACH与miCLIP-ARE两类位点在特征分布上存在明显区分（图S2A）。同时两类基序对应的miCLIP信号与RNA-Seq信号关联性较弱，表明miCLIP信号的变化并非源于mRNA表达或稳定性的改变（图S2B）。

依据miCLIP信号特征，CD8+T细胞内的mRNA 3'UTR可划分为4个类群（图2A）：高miCLIP-ARE信号、低miCLIP-RRACH信号的3'UTR（类群1）；整体表达水平偏低，但miCLIP-ARE与miCLIP-RRACH信号均较强的3'UTR（类群2）；低miCLIP-ARE、高miCLIP-RRACH信号的3'UTR（类群3）；以及高表达、ARE、RRACH区域miCLIP信号强弱存在差异的3'UTR（类群4）。

为评估CD8+T细胞激活对mRNA稳定性的影响及其与动态m6A位点的联系，该研究采用SLAM-Seq方法测定了未激活、活化第1天和第5天CD8+T细胞中的mRNA半衰期。检测结果显示，CD8+T细胞活化后整体mRNA半衰期缩短，细胞活化时间越久，转录本降解速度越快（图S2D）。对比各类群mRNA半衰期发现，同时携带miCLIP-ARE与miCLIP-RRACH位点的类群2转录本，半衰期显著短于miCLIP信号偏弱的转录本；而表达量高、miCLIP-RRACH信号较低的类群4转录本，半衰期最长（图2B）。

结合GLORI鉴定的m6A位点进一步分析，按照ARE基序与RRACH基序的间距分组后发现：m6A位点周边存在ARE序列时，对应mRNA的半衰期明显短于邻近无ARE序列的m6A位点（图2C）。在活化第5天的CD8+T细胞中，RRACH基序与ARE基序距离越近，mRNA半衰期就越短（图2C、2D）。整体来看，CD8+T细胞活化会加速转录本降解，其中ARE侧翼m6A位点对应的转录本降解效应最为显著（图S2E）。

为检验GLORI-Seq识别的m6A位点是否表现出相似的调控模式，该研究将其分为两类：仅RRACH位点和ARE侧翼m6A位点（即RRACH基序在±50nt范围内至少有一个ARE）。差异表达分析显示，在活化的T细胞中，这两个m6A亚类之间存在明显区别（图2E），ARE侧翼m6A位点比仅RRACH位点具有更短的半衰期（图S2F）。这些短寿命转录本与miCLIP-类群2有29%的重叠，包含多种免疫调控相关基因。这些结果提示，在T细胞激活过程中，ARE侧翼m6A位点与单纯RRACH型m6A位点对mRNA稳定性的调控作用存在差异，二者在T细胞免疫功能相关的转录后调控中扮演不同角色。

该研究结合效应T细胞、记忆T细胞相关转录模块展开分析，发现半衰期较短的转录本大多编码晚期效应蛋白与记忆相关蛋白，也是CD8+T细胞活化后降解最明显的一类转录本（图S2G、图S2H）。按照半衰期长短对活化第5天的mRNA分组后发现，编码晚期效应、记忆前体蛋白的基因大多为短寿命转录本，且集中分布在miCLIP类群2与对应GLORI类群中；而低m6A信号的转录本多为长寿命，主要参与细胞周期调控（图2G）。这说明3'UTR携带ARE侧翼m6A位点，是活化状态下T细胞记忆相关条件不稳定mRNA的典型特征。

该研究筛选出半衰期极短与半衰期极长的两类转录本，借助条件随机森林模型，结合m6A位点特征、细胞状态、基因功能模块、3'UTR序列特征等多项指标，构建mRNA稳定性分类模型。结果显示，依靠上述特征能够有效区分长寿命与短寿命转录本（图2H）。进一步分析表明，T细胞功能模块、miCLIP类群2特征以及3'UTR的ARE序列丰度，是判断mRNA稳定性的核心依据（图2I）。对比序列丰度可以看出，不同类群间ARE基序的分布差异远大于RRACH基序（图S2I）。

模型验证结果显示，该分类模型各项评估指标表现良好，可精准区分稳定与不稳定mRNA（图2J-2L）。综合分析证实，相较于单纯RRACH型m6A位点，ARE侧翼m6A位点对条件不稳定mRNA的预判能力更强。以上结果证实：在T细胞激活过程中，3'UTR内ARE的存在增强了m6A依赖性的mRNA降解作用。

CD8+T细胞必需mRNA上m6A相互关联的ARE位点的评估

为验证转录组学中关于CD8+T细胞功能关键基因的结论，该研究对携带ARE侧翼m6A位点与单纯RRACH型m6A位点的新生mRNA开展稳定性检测。该研究利用METTL3抑制剂处理CD8+T细胞，细胞活化第5天加入放线菌素D阻断转录，持续观测mRNA的降解过程。结果显示，抑制METTL3后，T细胞记忆标志物IL7R、效应核心分子TNF对应的mRNA稳定性显著提升，T细胞活化标志物CD69的mRNA稳定性也呈现上升趋势（图3A、图S3A）。METTL3抑制或缺失还导致多个与记忆形成相关的mRNA以及CD8+T细胞功能重要的趋化因子和细胞因子mRNA总体水平升高（图3B、图S3B、S3C）。

IL7Rα是CD8+T细胞的关键受体，其在细胞膜表达可作为长效记忆CD8+T细胞的判定标志。IL7R mRNA同时存在高可信度miCLIP-RRACH与miCLIP-ARE位点（图S3D），GLORI检测也证实其序列上存在距RRACH序列50nt以内的ARE侧翼m6A位点。与先前结果一致，抑制METTL3可提升IL7R mRNA稳定性与整体表达水平，同时细胞膜表面表达该蛋白的CD8+T细胞占比与表达强度也明显增加（图3A、3B、3C-F）。

TNFα、IFNγ等细胞因子同样是CD8+T细胞发挥功能的重要分子，这类物质可清除靶细胞但同时具有细胞毒性，因此其表达水平需要受到精细调控。记忆CD8+T细胞会提前储备IFNG与TNF的mRNA，细胞再次活化时无需启动新生转录，便可快速完成蛋白翻译。TNF与IFNG的mRNA均存在miCLIP-ARE位点，抑制METTL3能够上调二者的表达水平（图3B、图S3E、S3F）。

该研究进一步构建GFP报告系统探究m6A对TNFα、IFNγ表达的影响，分别将GFP与IFNG、TNF、GzmB的3'UTR融合并检测荧光强度（图S3E–S3H）。实验选取GzmB作为阴性对照，SLAM-Seq检测也证实GzmB mRNA半衰期较长，且活化状态下仅存在一个高可信度miCLIP-RRACH位点（图S3G）。该研究将重组载体导入CD8+T细胞，静置培养后使用不同浓度FTO抑制剂处理细胞，随后激活CD8+T细胞。实验结果显示，抑制FTO不会改变表达GzmB-3'UTR融合蛋白的阳性细胞比例；但表达IFNG-3'UTR、TNF-3'UTR融合蛋白的细胞，经抑制剂处理后荧光强度显著下降，GzmB组荧光水平则未出现明显变化（图3G、图S3J-3K）。

检测细胞分泌蛋白发现，CD8+T细胞活化过程中抑制FTO，会导致内源性IFNγ与TNFα的分泌量减少，且该处理不会影响T细胞整体活性（图3H-I）。以上结果表明，m6A甲基化可加速短寿命细胞因子mRNA降解，进而减弱活化CD8+T细胞的效应蛋白表达水平。

miCLIP-ARE位点在TNF mRNA水平调控中的相互作用

为验证ARE侧翼m6A位点是否确实存在m6A修饰，该研究采用了SELECT方法。研究聚焦于TNF mRNA的3'UTR，因为细胞因子TNFα对CD8+T细胞功能至关重要，且该区域含有一个明确的miCLIP-ARE位点（AUUUAUUA），位于RRACH基序（AGACA）15个核苷酸之内（图S3E）。

针对该miCLIP-ARE位点设计SELECT探针，利用SELECT技术检测METTL3敲除细胞，结果显示细胞内m6A水平明显下降（图3K、3L），表明无METTL3时m6A水平降低。METTL3敲除与FTO敲除细胞在该位点的扩增也存在显著差异（图3L）。这些结果表明，扩增曲线的变化由m6A修饰介导，且该过程受METTL3与FTO共同调控。进一步证明在特定RRACH侧翼的ARE位点上存在METTL3依赖的m6A修饰，提示这类复合基序作为一个独特的m6A调控单元发挥作用。

该研究随后利用GFP报告系统探究miCLIP鉴定出的基序特异性m6A特征对转录本表达的作用。将GFP分别与TNF野生型3'UTR、miCLIP位点突变型3'UTR进行融合（图S3O）。突变的TNF 3'UTR包括：miCLIP-ARE位点单点突变（A>G）、miCLIP-RRACH位点单点突变（A>G），以及两个位点的双突变。结果显示，与miCLIP-RRACH突变相比，miCLIP-ARE突变时GFP mRNA水平更高；双位点突变组的mRNA水平略低于仅miCLIP-ARE位点突变组（图3M，图S3P）。

为检测突变对蛋白表达的影响，该研究用PMA/离子霉素刺激转染后的CD8+T细胞16h，检测活化前后的GFP水平（图3N–3P）。细胞处于静息状态时，无法检测到GFP蛋白，但可检出GFP对应的mRNA（图3M、3N）。活化16小时后，所有条件下的GFP蛋白水平均升高（图3N），且miCLIP-ARE突变条件下的GFP强度高于野生型和miCLIP-RRACH突变（图3O、3P）。

这些结果表明，RRACH侧翼的ARE位点仅在完整的、能够发生m6A修饰的RRACH位点存在时，才能增强mRNA降解，仅突变RRACH位点不足以改变TNF mRNA水平。这些数据提示，m6A修饰的功能影响在某些情况下可能依赖于对甲基化RRACH及其侧翼ARE位点的组合识别。

miCLIP-ARE位点招募YTHDF蛋白及其他特异性RNA加工因子

为探究miCLIP-ARE位点是否调控RNA结合蛋白的招募，该研究首先检测了与特定ARE结合蛋白结合的RNA中m6A的富集情况。在Jurkat T细胞中使用针对经典m6A阅读蛋白（YTHDF1和YTHDF2）以及与T细胞生物学相关的ARE结合蛋白（HuR、ZFP36）的抗体进行CLIP实验。分离交联的RNA片段，通过LC-MS/MS定量m6A和腺苷水平（图S4A）。结果显示，与优先结合A-rich序列的polyA结合蛋白（PABP）相比，YTHDF1/2、HuR和ZFP36结合的RNA中m6A/A比值升高，说明m6A阅读蛋白和ARE结合蛋白结合的RNA区域均富集m6A。

为评估m6A的存在如何影响ARE附近的RNA-蛋白相互作用，该研究进行了基于定量质谱的RNA相互作用组捕获实验，使用合成RNA探针模拟miCLIP和GLORI图谱鉴定的关键序列背景。结果显示，含YTH结构域的蛋白（YTHDF1、YTHDF2、YTHDC1和YTHDC2）与m6A修饰的GGACU探针的结合强于未甲基化GGACU探针（图4A），证明单一m6A保守序列GGACU即可在T细胞中捕获经典m6A识别蛋白。实验同时发现，LSM家族多种RNA结合蛋白可特异性结合m6A修饰的UUAUU序列，与未修饰探针结合能力较弱（图4B、图S4B）。各类YTHDF同源蛋白同样可识别m6A修饰的UUAUU序列，但相较于未修饰GGACU探针，m6A修饰的UUAUU探针会排斥更多其他蛋白的结合（图4B、图S4B）。已有研究证实LSM蛋白可组装形成核糖核蛋白复合物，参与前体mRNA剪接与mRNA降解过程。

为测试miCLIP-ARE位点在天然序列背景下是否招募特定RNA结合蛋白，该研究针对TNF 3'UTR进行了pull-down实验。TNF 3'UTR探针包含下游紧邻RRACH基序的miCLIP-ARE位点。与上述结果类似，YTH旁系同源物和LSM家族蛋白特异性结合m6A修饰的TNF探针（图4C，图S4C）。

该研究进一步分析YTHDF、YTHDC同源蛋白及RBM15、RBM15b的iCLIP数据，验证miCLIP与GLORI筛选得到的高可信度ARE侧翼m6A位点能否作为经典m6A识别蛋白的结合区域。结果显示，已报道的YTHDF1结合标签在miCLIP-ARE位点与miCLIP-RRACH位点均存在富集，而在无miCLIP信号的对照ARE、RRACH位点中未出现富集（图4D、图S4D、S4E）。YTHDF1的结合信号在RRACH间隔≤50nt的miCLIP-ARE位点处呈现明显的单峰特征，在孤立的miCLIP-ARE位点中无此现象。两类miCLIP-RRACH位点均能观察到富集峰，其中紧邻ARE基序的RRACH位点交联信号分布范围更广（图4D、图S4E）。

综上所述，这些数据表明，m6A修饰的ARE可招募LSM蛋白和YTHDF蛋白，它们可能通过YTHDF依赖性途径协同调控mRNA降解。该研究提出作用模型：与单独的RRACH m6A位点相比，RRACH侧翼的ARE形成复合m6A基序，组装独特的核糖核蛋白复合物，从而在活化的CD8+T细胞中更强地促进mRNA失稳（图4E）。