Nature子刊｜tRNA修饰研究新利器：CRACI技术实现D修饰单碱基定量测序

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引言

二氢尿苷（D）是RNA中最古老、最丰富的化学修饰之一，存在于细菌、真核生物tRNA的D-loop中，是仅次于假尿苷（Ψ）的第二大修饰核苷。其饱和环结构可调控RNA的折叠与功能。哺乳动物tRNA上的D修饰由二氢尿苷合成酶（DUS）催化，其家族成员DUS1L、DUS2L、DUS3L、DUS4L与肺癌、结直肠癌等疾病密切相关。此外，mRNA上也存在低丰度的D修饰，但其分布和功能尚不明确。

尽管D修饰的重要性日益凸显，但传统检测方法（如AlkAniline-Seq、Rho-seq、D-seq）依赖逆转录终止信号，灵敏度低、无法定量、难以解析密集修饰区域。

近日，芝加哥大学何川教授团队联合香港科技大学张理升教授团队在nature communications发表成果《Quantitative CRACI reveals transcriptome-wide distribution of RNA dihydrouridine at base resolution》，报道了一种名为CRACI（Chemical Reduction Assisted Cytosine Incorporation sequencing）的全新检测技术，首次绘制了人、小鼠及拟南芥tRNA的高精度D修饰图谱，实现了对D修饰的全转录组、单碱基分辨率及精确定量测序。

云序生物紧跟领域前沿，推出单碱基D修饰测序服务，为客户提供从tRNA到mRNA的全转录组D修饰精准解析，助力疾病机制、发育调控及RNA功能研究的前沿探索。该技术具备以下核心优势：

单碱基分辨率：KBH4还原后D位点产生约96%的T→C突变，直接读取每个位点的修饰状态，解析邻近D之间的顺式调控关系。
温和还原条件：KBH4中性条件温和还原，避免RNA降解，保证低丰度RNA（如线粒体tRNA）高效回收。
突变率量化修饰率：高dGTP/dNTP组合使逆转录酶高效读通，将D信号转为内部突变，实现密集修饰区域完整定量。
UMI精准去重：可以在3’接头中引入UMI（分子唯一标识符），去除PCR重复，校正扩增偏倚，低起始量样品亦可获得高保真结果。

接下来，我们将对该论文的核心研究方法与主要实验结果进行详细解读，帮助各位老师全面了解CRACI的技术原理及其在D修饰研究中的广阔应用前景。

研究方法

1) 实验材料

细胞培养（HepG2、mESC）与拟南芥种植：提供不同物种（人、小鼠、植物）的RNA来源，用于跨物种D修饰图谱比较。

体外转录（IVT）制备无修饰mRNA：polyA+RNA经逆转录、双链cDNA合成及T7体外转录获得不含任何RNA修饰的IVT mRNA，作为CRACI分析中扣除背景突变的阴性对照。

线粒体tRNA分离与富集：使用线粒体分离试剂盒提取线粒体，再通过生物素标记的反义寡核苷酸探针杂交捕获特定线粒体tRNA，用于后续LC-MS/MS或CRACI验证。

2) 高通量测序与分析方法

单碱基D修饰测序（CRACI-Seq）：通过KBH4将D温和还原为四氢尿苷，利用高dGTP/dNTP条件下的HIV逆转录酶将D信号转化为T→C突变，实现全转录组、单碱基分辨率、定量的D修饰检测。

合成RNA寡核苷酸梯度混合+校准曲线：针对256种NNDNN序列基序，建立突变率与D修饰分数的线性关系（y = Ax + b），用于将测序观测到的T→C突变率换算为实际的D化学计量比。

3) D修饰验证及机制解析

LC-MS/MS（液相色谱-串联质谱）：定量检测线粒体tRNA中D及四氢尿苷的真实含量，验证CRACI鉴定出的D位点和修饰比例。

siRNA介导的DUS酶敲低：鉴定各DUS酶在细胞内负责的特定D位点，并观察D修饰之间的顺式调控及补偿效应。

研究结果

CRACI将D修饰检测从RT终止转化为碱基突变，实现D的精准定量

通过筛选多种逆转录酶和优化反应条件（KBH4还原+高dGTP/dNTP比例下的HIV逆转录酶），CRACI成功将D修饰信号转化为高比例（平均约96%）的T→C突变，而非传统的RT截断。针对256种NNDNN序列基序，CRACI均表现出高的突变率（91%-99%）且序列偏倚极小，为定量检测奠定了基础。通过合成含0%-100% D分数的RNA标准品（每种NNDNN基序），CRACI建立了突变率与D修饰比例之间的线性校准曲线（y = Ax + b）。该曲线覆盖所有序列类型，线性范围宽，能够将实际样品中的T→C突变率准确换算为D修饰化学计量比。

图1. 单碱基定量D修饰测序技术——CRACI的开发

CRACI绘制人HepG2细胞质与线粒体tRNA的定量D图谱

在HepG2细胞质tRNA中，CRACI仅检测到16、17、20、20a、20b、47位点的D修饰，无其他位点信号。这些位点的修饰化学计量比呈现动态范围（如D16/D17>70%，D20a介于20%-100%）。通过与已知DUS2L、DUS1L、DUS3L的iCLIP数据及Modomics数据库比对，CRACI鉴定结果高度一致，验证了其高准确性。

在线粒体tRNA中，CRACI仅在mt-tRNA[Asn] D17、mt-tRNA[Asn] D20、mt-tRNA[Gln] D16、mt-tRNA[Gln] D20和mt-tRNA[Leu] D20位点检测到D修饰，其中三个高修饰位点（>90%）与质谱结果一致，两个中等修饰位点（<40%）为新鉴定，展示了CRACI的高灵敏度。

图2. CRACI定量分析HepG2 tRNA中的D位点

CRACI明确人tRNA中各D位点对应的writer蛋白

通过siRNA分别敲低二氢尿苷合酶（DUS）蛋白DUS1L、DUS2L、DUS3L、DUS4L，结合CRACI定量分析，明确：

DUS1L负责D16/D17；
DUS2L负责D20；
DUS3L负责D47；
DUS4L负责D20a。

此外，敲低单个DUS酶常引起其他D位点修饰水平补偿性上升。线粒体tRNA中，DUS2L被证实负责D16、D17、D20的催化。

图3. CRACI明确人tRNA中各D位点对应的writer蛋白

CRACI揭示D20a对D20的顺式负调控

通过比较同时含有D20和D20a的tRNA与仅含D20的tRNA，发现当DUS4L敲低导致D20a缺失时，D20修饰水平显著升高；而DUS2L敲低不影响D20a。这表明D20a在tRNA成熟过程中先于D20安装，并负调控DUS2L对D20的修饰，揭示了同一RNA分子上相邻D修饰之间的顺式调控关系。

图4. 人细胞质tRNA中相邻D修饰的相互作用和共调控

CRACI比较小鼠（mESC）与人及植物中的D修饰图谱

在小鼠mESC细胞质tRNA中，CRACI检测到D16、D17、D20、D20a、D20b、D47，分布模式与人HepG2类似。但线粒体tRNA中仅检测到D20位点。在拟南芥中，细胞质tRNA的D位点与哺乳动物相似，线粒体tRNA出现更丰富的D修饰（D16、D17、D20、D20a），叶绿体tRNA也检测到D16、D17，且叶绿体23S rRNA存在保守的D2467位点（对应细菌D2449）。跨物种比较显示D16、D17、D20、D47高度保守，D20a保守性较弱。

图5. CRACI在小鼠细胞（mESC）和拟南芥中揭示了D修饰谱

CRACI鉴定人mRNA中存在极低丰度的D修饰

利用体外转录（IVT）无修饰mRNA作为背景对照，CRACI在HepG2 mRNA中仅鉴定出8个高置信D位点，修饰化学计量比介于10%-40%。该结果首次以单碱基分辨率定量证实人mRNA确实存在D修饰，但位点稀缺且丰度低。同时，CRACI在rRNA、snRNA、snoRNA等其他ncRNA中未检测到D信号（图6）。未来需要使用原代细胞、真实组织样本和各种应激条件下的细胞进行进一步研究，以获得更全面的了解。

图6. 人类mRNA中存在低丰度的D修饰

D修饰的研究热潮正在缓缓涌来，在CRACI技术诞生之前和同期，已经有一批精彩的研究从不同角度揭示了D修饰的多样功能与调控机制，涵盖DUS酶的结构与底物识别、D修饰在细菌应激响应中的机制和在人类疾病进展中的潜在作用。以下我们精选了近期D修饰领域的代表性研究成果，供感兴趣的读者延伸阅读：

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tRNA二氢尿苷合成酶DusA在优化tRNA以促进翻译方面具有独特的机制

标题：The tRNA dihydrouridine synthase DusA has a distinct mechanism in optimizing tRNAs for translation

发表时间：2026/5/4

发表期刊：Nucleic Acids Research

影响因子：13.1

研究摘要：二氢尿苷（D）是生命所有领域中最高度保守的RNA修饰之一。tRNA D环中的D20位点尤其保守，由大肠杆菌中的DusA催化形成。然而，DusA及D20的作用机制和细胞功能仍不甚清楚。本研究揭示了DusA在tRNA结合、辅因子氧化及修饰活性方面的功能，并阐明了其对tRNA成熟和翻译的影响。DusA通过一种涉及局部结构重排的两步机制与tRNA结合，且与未修饰的tRNA相比，DusA对已预先修饰的tRNA表现出更高的亲和力。与TrmA和TruB不同，DusA并不会广泛提高所有tRNA的细胞内氨酰化水平，而是增强特定tRNA种类的氨酰化。尽管在缺乏DusA的细胞中，整体tRNA氨酰化水平和丰度变化有限，但DusA选择性地改善了几种特定密码子处的翻译效率，这可能表明二氢尿苷直接促进某些tRNA在核糖体上的功能。总之，研究结果表明，DusA与TrmA和TruB在精细调控蛋白质合成中既具有非冗余功能，又相互补充。

tRNA二氢尿苷化的功能冗余

标题：Functional redundancy in tRNA dihydrouridylation

发表时间：2024/4/29

发表期刊：Nucleic Acids Research

影响因子：13.1

研究摘要：二氢尿苷（D）是一种常见的修饰碱基，主要存在于转运RNA（tRNA）中。尽管其普遍存在，但D生物合成的机制，尤其是在原核生物中，一直尚未明确。研究通过遗传学、生物化学和表观转录组学方法，对枯草芽孢杆菌中的D生物合成进行了全面研究。结果表明，枯草芽孢杆菌依赖两种FMN依赖性Dus样黄素蛋白同源物——DusB1和DusB2——来向其tRNA中引入所有D残基。值得注意的是，DusB1具有多位置酶活性，能够催化D在17、20、20a和47位点的形成；而DusB2则特异性地催化D在20和20a位点的生物合成，显示出修饰酶之间的功能冗余性。全tRNA范围的D定位表明，这种功能冗余影响了大多数tRNA，其中DusB2的二氢尿苷化效率比DusB1更高。有趣的是，研究发现，当BsDusB2在体内过表达或在体外酶浓度升高时，它可以像BsDusB1一样发挥作用。此外，研究还证实了D修饰对于枯草芽孢杆菌在次优温度下生长的重要性。研究拓展了对原核生物中D修饰的认识，突显了该过程中功能冗余的重要性及其对细菌生长和适应的影响。

由hDUS2介导的序列和结构特异性tRNA二氢尿苷化

标题：Sequence - and Structure-Specific tRNA Dihydrouridylation by hDUS2

发表时间：2024/3/12

发表期刊：ACS Central Science

影响因子：10.2

研究摘要：二氢尿苷合成酶（DUS）催化的尿苷向二氢尿苷（D）的转录后还原是RNA生物学中最普遍的转化之一。D在tRNA的多个位点存在，酵母中的研究表明四种真核DUS酶各自修饰不同的位点；然而，这种高度选择性的分子基础尚不清楚，且人类DUS酶在很大程度上仍未被充分表征。研究利用5-溴尿苷（5-BrUrd）修饰寡核苷酸探针进行交联，并结合体外二氢尿苷化测定，研究了人二氢尿苷合成酶2（hDUS2）的底物特异性。发现hDUS2在不同tRNA底物中专一地修饰U20位点，并鉴定出tRNA D环内的一个最小GU序列，该序列是底物选择性修饰的基础。此外，研究筛选了hDUS2的小分子抑制剂，hDUS2是一个潜在的抗癌靶点。该研究阐明了一个保守DUS对底物修饰的原则，为利用具有序列确定性的活性探针研究RNA修饰酶提供了一个通用平台。

tRNA上二氢尿苷形成的分子基础

标题：Molecular basis of dihydrouridine formation on tRNA

发表时间：2011/11/28

发表期刊：PNAS

影响因子：9.1

研究摘要：二氢尿苷（D）是一种高度保守的修饰碱基，广泛存在于动物、植物、微生物的tRNA中。二氢尿苷合成酶（Dus）以黄素单核苷酸（FMN）为辅因子，通过还原尿嘧啶碱基催化tRNA中D的形成。在此，研究报道了嗜热栖热菌Dus（TthDus）与tRNA以及与tRNA短片段（D环）复合物的晶体结构，TthDus负责催化20和20a位点的D形成。Dus与D臂广泛相互作用，并识别由tRNA中T环与D环之间“kissing loop”相互作用形成的肘部区域，将U20拉入催化中心进行还原。尽管观察到Dus与tRNA结合后D环结构发生扭曲，但典型的D环/T环相互作用仍得以维持。这些结果与Dus优先识别已修饰tRNA而非未修饰tRNA的观察一致，表明Dus通过监测tRNA完整的L形结构来引入D20。在活性位点，U20堆叠在FMN的异咯嗪环上，U20尿嘧啶环的C5与Cys93的巯基形成共价交联，暗示了D20形成的催化机制。此外，研究提出了辅因子分子参与尿嘧啶环识别的机制。基于一系列突变分析，研究提出了Dus识别tRNA和催化D形成的分子基础。

结语

D修饰是跨物种最丰富、进化上最为保守的RNA化学修饰之一，其相关DUS酶已被证实与多种人类疾病密切相关。然而，长期以来，由于缺乏精准、定量的检测工具，D修饰在基因调控中的真实功能——尤其是在mRNA和tRNA中的作用——几乎是一片未被深入开垦的沃土。

CRACI技术的出现，正是为这一领域打开了一扇全新的大门。作为首个能够实现全转录组、单碱基分辨率、定量检测D修饰的技术平台，CRACI不仅首次绘制了跨物种（人、小鼠、植物）的tRNA D修饰图谱，更揭示了邻近D位点之间的顺式调控、线粒体tRNA中全新的D修饰位点、以及DUS酶与底物之间的精准对应关系。这些发现只是冰山一角。

借助单碱基D修饰测序，tRNA D修饰研究拥有广阔前景：

疾病机制：DUS酶在肿瘤、神经发育异常中是否通过修饰tRNA或mRNA影响关键蛋白翻译？

环境应答：D修饰是否在热激、缺氧、氧化应激等条件下动态变化，调控细胞适应能力？

合成生物学：能否通过定向改造DUS酶，实现tRNA功能的可编程调控？

CRACI为上述每一个问题都提供了前所未有的技术可能。这项技术不仅是对过去几十年D修饰研究的延续，更是一个全新起点的开始。

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云序生物RNA修饰优势

优势一：RNA修饰产品线齐全，热门修饰IP类/单碱基分辨测序 + IP试剂盒

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RNA修饰测序是云序生物转录调控及表观组学旗下的重磅产品。在国内，目前云序生物具有全面的RNA修饰测序平台。云序累计助力客户发表300+篇RNA修饰SCI论文，影响因子1500+，累计完成数千例RNA甲基化测序样本，全面覆盖医口、农口等各类样本。文章涉及多种组学联合方案提供RNA修饰一站式服务，包括上游整体修饰水平的检测、RNA修饰高通量测序、测序后的验证实验，还提供“各类分子互作组研究”服务，助力探究深层分子作用机制！如果您有更多的想法及需求，欢迎与我们联系！

云序生物介绍

上海云序生物科技有限公司（简称“云序生物”）成立于2015年，坐落于上海漕河泾新兴技术开发区，是国家高新技术企业及ISO9001认证单位。公司以RNA修饰组、表观遗传学与新型时空组学为特色，依托高通量测序、质谱技术、生物信息学等平台，致力于为全球科研与临床用户提供专业、精准、系统性的组学解决方案。云序生物以“技术创新+全链条服务”为核心，通过专利技术应用（如GLORI）、临床微量样本技术优化及单细胞-空间多组学整合能力，持续推动表观遗传与转录组学发展，赋能基础科研与精准医疗。

核心优势与创新技术

一、专利技术与特色平台

1. RNA修饰测序技术

专利授权GLORI技术：获北京大学《Nature Biotechnology》发表的单碱基分辨率m6A测序金标准专利授权，实现RNA甲基化图谱的精准解析。

全面单碱基修饰检测：提供m6A、ac4C、m5C、m7G、m1A、O8G等全类别RNA修饰单碱基测序服务，覆盖修饰研究全维度需求。

2. 环状DNA研究全链条服务

核心资源：独家代理国际知名品牌A&A Bio的环状DNA富集纯化柱，实现环状DNA的高效富集，为环状DNA测序保驾护航。

系统性服务：全面提供Circle-Seq、体液eccDNA测序、体液eccDNA甲基化测序等特色服务。

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针对血浆、FFPE、微量细胞等珍贵样本，推出高灵敏度表观组与转录组技术，如cfMeDIP-Seq，cfDNA EM-Seq，超微量MeRIP-Seq，绝对定量cfRNA测序等。

4. 表观遗传组综合研究平台

覆盖DNA/RNA互作、染色质开放性、组蛋白修饰全维度，如：

R-loop研究（ssDRIP-Seq、DRIPc-Seq、R-loop CUT&Tag）

蛋白-RNA互作（RIP-Seq、RNA Pull-down-MS）

染色质可及性（ATAC-Seq）

组蛋白修饰（CUT&Tag、ChIP-Seq）

DNA修饰（MeDIP-Seq、hMeDIP-Seq和EM-Seq）

5. 前沿时空组学技术

提供各类前沿单细胞多组学与空间原位分析技术，如3’/5’端单细胞转录组测序、单细胞BCR/TCR测序、单细胞ATAC-Seq、单细胞组蛋白修饰测序和空间转录组等。

·云序生物全产品目录·

RNA修饰组
单碱基法	抗体富集/生物素标记法
m6A GLORI-Seq	m6A MeRIP-Seq (Spike In Plus)
m5C Bis-Seq	m5C MeRIP-Seq
m7G AlkAniline-Seq	m7G MeRIP-Seq
m7G TRAC-Seq	m7G MeRIP-Seq
m1A MAP-Seq	m1A MeRIP-Seq
ac4C Reda C:T-Seq	acRIP-Seq
假尿嘧啶 BID-Seq	Ψ-RIP-Seq
假尿嘧啶 BACS-Seq	Ψ-RIP-Seq
单碱基O8G miSeq	O8G-IP-Seq
2'-O甲基化NM-Seq	m6Am-Seq
m3C AlkAniline-Seq	5hmC hMeRIP-Seq
小RNA 2'-O-RiboMeth-Seq	GlycoRNA Pandora-Seq
cfRNA多修饰测序(LIME-Seq)	Long GlycoRNA-Seq
单碱基D修饰测序(CRACI-Seq)

DNA修饰组
5mC DNA甲基化测序	5hmC DNA羟基化测序
5mC cfDNA/ctDNA甲基化测序	5hmC cfDNA/ctDNA羟基化测序
单碱基DNA甲基化测序（EM-Seq）	6mA DNA甲基化测序
O8G DNA修饰测序	5caC DNA羧基胞嘧啶测序
5fC DNA甲酰基胞嘧啶测序

表观基因组
ATAC-Seq	Cut&Tag
ChIP-Seq	超微量cfDNA ChIP-Seq
G4 ChIP-Seq	G4 Cut&Tag

转录调控组和翻译组
翻译组测序(Ribo-Seq)	多聚核糖体测序(Polysome-Seq）
微量GRO测序(rGRO-Seq)	微量PRO测序(rPRO-Seq)
新生转录本测序(Slam-Seq)	氨酰tRNA测序(mim-tRNA-Seq)
RNA G-四链体测序(rG4-Seq)

分子互作组
RNA Pull down-质谱/MS	RIP-Seq
ChIRP-Seq/MS	CoIP/MS
ssDRIP-Seq	DRIPc-Seq
eCLIP-Seq	R-loop Cut&Tag

转录组
全转录组测序	tRNA测序
环状RNA测序	小RNA组测序（Pandora-Seq）
mRNA测序	tiRNA&tRFs测序
microRNA测序	piRNA测序
外泌体RNA测序	cfRNA测序
Dual RNA-Seq	caRNA/carRNA测序
LncRNA测序	细菌sRNA测序
dsRIP-Seq	细菌msRNA测序

单细胞测序与空间转录组学
单细胞转录组测序	单细胞ATAC-Seq
单细胞ChIP-Seq	空间转录组测序

基因组
ecDNA测序（WGS）	组织细胞eccDNA测序（Circle-Seq）
体液样品eccDNA测序	体液样品eccDNA甲基化测序
环状DNA PCR验证	环状DNA Sanger测序验证
外显子组	全基因组