SpaceFRET的组装与表征

SpaceFRET被设计为一种模块化、双编码报告系统，将特定RNA序列与代谢标记的聚糖的共同存在转化为可激活的荧光共振能量转移（FRET）信号（图1A）。SpaceFRET包含三个功能组件：(i)聚糖编码（GC），由P链与GC*（GC*5’端带有用于SPAAC的DBCO‑TEG基团，3’端带有Cy3供体）杂交形成的双链；(ii)RNA编码（RC），内部标记有Cy5受体的发夹探针；以及(iii)聚糖解码器（GD），与P链完全互补。在完整细胞中，GC通过SPAAC共价标记叠氮标记的聚糖，而RC通过序列特异性杂交编码RNA成分。引入GD后会竞争性结合P链并触发链置换反应，解离GC双链，释放单链GC*。释放的GC*随后侵入RC的互补区域，展开发夹，形成线性RC‑GC*双链，将Cy3和Cy5拉近纳米级距离（<10nm）以激活FRET。

采用天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）验证了所设计的组装和解码过程的每一步（图1B）。为直接追踪解码链并明确解析链置换产物，研究将GD标记上Cy5（Cy5‑GD）。GC*（泳道1）和RC（泳道2）均迁移为清晰的条带。将RC与GC*混合（泳道3）产生了一条迁移速度较慢的条带，表明GC*足以打开RC发夹并通过互补碱基配对形成稳定的RC‑GC*复合物。P与GC*的杂交生成了预期的GC双链（泳道4）。在加入Cy5‑GD到GC（泳道5）后，出现了一条新的、迁移速度更慢的条带，这与形成高分子量GD‑P双链体伴随GC*释放的现象一致。相比之下，GC与RC单独孵育并未显著展开RC（泳道6），而加入GD则恢复了RC展开和RC‑GC*复合物的形成（泳道7），证明GD介导的解码是必需的，用以调控下游GC‑RC识别（图1B）。

荧光光谱进一步证实了SpaceFRET在群体水平上的激活（图1C,D）。单独组件在供体激发波长（548nm）激发时产生的Cy5发射信号极弱，而解码后完整体系组装则产生与FRET现象相符的显著受体发射信号。670nm处的终点荧光强度与全光谱测量结果一致，证实了报告基因组装后信号可靠地被激活。值得注意的是，添加Y5 RNA并未扰动组装报告基因的FRET特性（图1C,D），表明靶点结合与FRET激活所需的构象重排是兼容的。

随后通过PAGE和流式细胞术（FCM）（图1E,F）评估了活细胞中每个编码模块的特异性。在用Ac4ManNAz进行代谢标记后，94.90%的细胞呈Cy3-GC阳性，而未标记的细胞中只有0.20%呈现Cy3阳性。使用PNGaseF酶解去除细胞表面N‑聚糖后，Cy3阳性率降至1.13%，这表明GC选择性地编码细胞表面的叠氮标记聚糖。对于RNA编码，83.0%的细胞对Cy5‑RC呈阳性。用RNase混合物（A/T1）处理后，Cy5阳性群体降至0.54%，而RNase抑制则将阳性率恢复至82.5%，表明RC识别依赖于完整的细胞表面RNA。

细胞表面glycoRNA的原位成像：基于SpaceFRET技术

为确保SpaceFRET分析能够应用于细胞模型，研究寻找独立的生化证据，以证明本研究中所用乳腺细胞系中存在Y5糖基化RNA。

对MCF10A、MCF-7和MDA-MB231细胞进行GlycoRNA-qPCR验证：通过rPAL法富集糖基化RNA并进行RT-qPCR分析。结果显示在所有三种细胞系的糖基化RNA富集组分中均能稳定检测到Y5（图S4）。

为使用SpaceFRET验证细胞表面存在sia‑糖基RNA，MCF‑7细胞经100μM Ac4ManNAz代谢标记48小时，然后进行点击化学反应、变性凝胶电泳和抗生物素蛋白印迹。仅在Ac4ManNAz标记样本中检测到强烈的生物素信号，而未标记的对照组未显示可检测信号（图2B）。生物素信号被RNaseA/T1和PNGaseF消除，在加入了RNase抑制剂又重新恢复，表明这是一种RNA连接的、依赖于N-聚糖的修饰。相比之下，蛋白酶K和O‑糖苷酶并未显著改变生物素信号模式，排除了蛋白质污染以及在此条件下以O-连接糖基化为主的可能性（图2B）。凝胶和印迹泳道的光密度图谱进一步表明背景标记低且RNA与生物素分布高度一致（图2C）。

接下来，研究应用SpaceFRET原位可视化细胞表面糖基RNA。Ac4ManNAz标记的MCF‑7细胞的共聚焦成像显示，细胞边缘存在可检测的Cy3和Cy5信号以及强烈的FRET发射（图2D）。重要的是，省略任何关键组分（GC、RC或GD）会导致接近背景的FRET信号和FRET读数显著降低（P<0.0001；图2E），这与成像设置下的最小光谱串扰一致，并证明SpaceFRET输出严格依赖于GC-RC双重识别和GD介导的解码。

为了验证该方法在细胞上的基序特异性，Ac4ManNAz标记的MCF‑7细胞经RNaseA/T1消化、PNGaseF或α2−3,6,8,9‑神经氨酸酶A处理，或用NGI‑1或脱氧氨基葡萄糖激酶抑制N‑糖基化，随后进行SpaceFRET染色。与对照组相比，每种处理都使SpaceFRET信号减少>99%（图2D），但经O‑糖苷酶处理后仍基本保持，证实读数依赖于glycoRNA的RNA和N‑聚糖成分。

由于Cy3标记的GC可编码多种表面聚糖（包括糖蛋白和糖脂）上的叠氮标记唾液酸糖基，SpaceFRET糖基RNA读数需要GC和序列编码RC的同时招募。同时，流式细胞术测量证实，仅当所有组分（GC、RC和GD）都存在时才会出现明显的SpaceFRET阳性偏移，而省略任何组分都会导致信号接近背景分布（图2F）。

通过SpaceFRET在细胞表面进行glycoRNA的标记和成像

代谢标记方法可能存在代谢转化不完全和细胞内异质性转运的问题，这可能导致不同细胞类型和亚细胞标记不均匀。为了实现与SpaceFRET兼容的表位选择性及表面限制性标记，研究结合了糖基转移酶介导的糖链编辑和化学氧化标记技术。

具体而言，研究使用了唾液酸转移酶和岩藻糖基转移酶及其相应的叠氮供体底物——CMP‑叠氮唾液酸（CMP‑Neu5Az）和GDP‑6‑叠氮岩藻糖（GDP‑Fuc‑N3），将可点击的唾液酸和岩藻糖安装到MCF‑7细胞表面的唾液酸化末端和LacNAc基序上。同时，半乳糖氧化酶（GAO）选择性地氧化末端Gal/GalNAc残基，生成生物正交醛基（包括glycoRNA上的醛类），这些醛类随后使用酰肼-PEG₄-叠氮（Hz-PEG₄-N₃）进行衍生化。这些化学酶促反应在三种代表性末端表位（包括唾液酸化、LacNAc和Gal/GalNAc）上安装统一的叠氮基团，从而能够在细胞表面实现糖基化形式分辨的SpaceFRET解码。

为验证上述反应特异性标记RNA相关糖基化形式，研究从MCF‑7细胞中提取总RNA，并使用ST8SiaVI/CMP‑Neu5Az标记唾液酸化糖基化RNA，使用α1，3 FucT/GDP‑Fuc‑N3标记含LacNAc的糖基化RNA，或使用GAO氧化后经Hz-PEG₄-N₃衍生化标记末端Gal/GalNAc糖基化RNA。随后，叠氮标记的RNA通过SPAAC与DBCO‑PEG4‑biotin偶联，并通过变性琼脂糖凝胶电泳和Northern印迹分析（图3A）。抗生物素检测显示，Sia‑glycoRNA、LacNAc‑glycoRNA和Gal/GalNAc‑glycoRNA在广泛的RNA尺寸范围内均显示出强烈的生物素信号（图3B）。重要的是，这些信号在RNase（A/T1）消化后消失，并在使用RNase抑制剂阻断RNase（A/T1）时恢复，证实检测到的生物素信号是RNA依赖性的，而不是来自污染的非RNA糖基化共价物。

接下来，研究对完整的MCF‑7细胞进行了细胞表面标记，并使用SpaceFRET可视化了产生的glycoRNA。ST8SiaVI介导的Neu5Az标记使Sia‑glycoRNA的选择性原位成像成为可能，而未添加ST8Sia VI的对照组信号接近背景水平（图3C）。类似地，使用α1,3FucT/GDP-Fuc-N₃标记后，产生对应于LacNAc-糖基化RNA的强烈SpaceFRET信号，而酶阴性对照的信号仍然很低（图3D）。对于Gal/GalNAc‑glycoRNA，GAO氧化后进行Hz‑PEG4‑N3衍生化产生了显著的SpaceFRET读数，而在GAO缺失的情况下则丢失了该读数（图3E）。

随后研究探讨了glycoRNA的糖基化形式是否随乳腺癌进展而变化，将MCF‑10A、MCF‑7和MDA‑MB‑231作为恶性程度增加的代表模型进行比较（图4A-C）。针对Sia-糖基化RNA、LacNAc-糖基化RNA和Gal/GalNAc-糖基化RNA的SpaceFRET成像显示，从MCF-10A到MCF-7再到MDA-MB231，信号呈逐渐下降趋势。这些数据表明，在肿瘤进展过程中，多个糖基化RNA相关的聚糖特征发生了协同重塑（图4D）。

为了评估SpaceFRET在乳腺来源模型之外的普遍适用性，研究将SpaceFRET分析扩展至HEK293（人胚肾来源）、LoVo（结肠癌）和A549（肺腺癌）细胞。所有三种细胞类型均表现出清晰的膜相关FRET读数，针对Sia-、LacNAc-和Gal/GalNAc-糖基化RNA均如此。通过单细胞FRET定量总结为热图，以提供跨细胞类型的简明糖型谱（图S18）。这些结果表明，SpaceFRET能够实现跨细胞状态下细胞表面糖基化RNA的原位、糖型分辨的可视化及比较分析。正交的Northern印迹分析及扩展的细胞类型组进一步支持，成像趋势反映了糖基化RNA丰度的生物学变化。

外泌体表面sia‑糖基化RNA有助于外泌体在小鼠体内的生物分布

首先确认唾液酸化糖基化RNA是否显示在外泌体（sEVs）的外膜上。通过差异超速离心，从MCF‑7细胞条件培养基中分离出外泌体，并随后用ST8SiaVI进行酶促标记，该酶将CMP−Neu5Az中的Neu5Az转移到末端的唾液酸上，从而为下游点击化学安装了一个叠氮基团（图5A）。TEM和NTA验证了预期的外泌体形态和尺寸分布，免疫印迹证实了sEV组分中富集了经典的sEV标志物（TSG101、CD63和CD9）（图5C）。

为了生化验证叠氮基团存在于RNA种类上，通过点击化学偶联生物素，从标记的外泌体中提取RNA，并通过变性凝胶电泳和RNA印迹分析产物。检测到强烈的生物素信号，并在RNaseA/T1消化后消失，而加入RNase抑制剂则保留了信号（图5B），这与sEV制备中RNA被标记的结果一致。为了直接可视化表面暴露的糖基RNA，研究将标记的外泌体固定在醛/硫酸盐乳胶微珠上。SEM显示外泌体在珠表面均匀覆盖（图5C）。共聚焦SpaceFRET成像显示，在微珠外周出现特征性的环状FRET图案，表明糖基化RNA呈现在结合于微珠的sEVs外膜上。该FRET信号经PNGase F处理或RNase A/T1消化后显著减弱，而在抑制RNase A/T1时信号得以恢复（图5D），支持该信号依赖于聚糖和RNA两种组分。

肿瘤来源的外泌体（sEVs）可以扩散到远处器官并调节转移前微环境。因此，研究测试了去除表面暴露的RNA是否会影响体内sEVs的生物学分布。sEVs被标记了近红外亲脂染料DiR，该染料已被报道不会干扰外泌体的生物学分布，并在尾静脉注射前用RNaseA/T1处理以去除表面暴露的RNA（图5E）。注射后24小时的离体IVIS成像显示，与对照组相比，RNase处理的sEVs在多个器官中的积累显著减少（图5F），更广泛的器官和生物体液分布特征如图S21所示。综合这些数据表明，sEVs表面的暴露RNA，包括唾液酸化glycoRNA，可能通过与细胞−表面受体的相互作用，有助于全身摄取和器官分布。值得注意的是，数据并未排除非糖基化表面RNA的功能贡献。

外泌体表面的糖基化RNA

为确定与外泌体相关的glycoRNA的存在，使用N-叠氮乙酰甘露糖胺（Ac4ManNAz）对乳腺上皮细胞（MCF‑10A、MCF‑7和MDA‑MB‑231）进行代谢标记。收集培养液后，通过超速离心分离外泌体，使用纳米颗粒追踪分析（NTA）、透射电镜（TEM）以及针对经典sEV标志物（TSG101和CD63）的免疫印迹法对分离的外泌体进行表征，同时验证内质网标志物calnexin的缺失（图1b、1c）。从标记的外泌体中分离的总RNA通过与DBCO‑PEG4‑生物素发生无铜点击化学反应，并使用链霉亲和素富集glycoRNA（图1d）。仅在Ac4ManNAz标记的样品中观察到强烈的生物素信号，并且被RNase混合物（RNaseA/T1）消除，而蛋白酶K或DNaseI处理没有影响（图1e）。此外，用神经氨酸酶或PNGase F处理可消除标记信号，但O-糖苷酶处理则不能（图1f），这与唾液酸化、N-连接的糖基化RNA结构特征一致。

为检测这些糖基化RNA是否暴露于完整sEVs的外表面，在非通透化条件下直接将点击反应应用于纯化后的外泌体，然后提取RNA并进行印迹检测。结果检测到强烈的标记信号，而当完整sEVs预先用RNase（A/T1）处理后，该信号显著减弱，表明大部分可与生物素反应的糖基化RNA位于sEVs的外表面（图1g）。值得注意的是，在乳腺癌恶性程度系列中，从MCF‑10A到MCF‑7再到MDA‑MB‑231的sEVs，其表面可接近的糖基化RNA信号丰度依次降低，这与以往报道中表面糖基化RNA水平与恶性表型相关的结论一致。

PREDICTOR的组装与表征

为能在完整sEVs上原位可视化表面glycoRNA，研究设计了PREDICTOR系统：包含一个识别模块和一个组装（信号放大）模块（图2a）。识别模块由两个分离探针组成：糖基探针（GP）和RNA探针（RP）。GP集成了Neu5Ac结合适配体、间隔子和分离触发链，使其能够报告唾液酸化糖基特征。RP包含一个与目标RNA序列互补的区域以及一个匹配的分离触发链。只有当GP和RP在单个glycoRNA上紧密邻近结合时，分离触发链才会通过杂交重新组合，从而产生下游放大所需的起始子。

组装模块通过一个无酶、toehold介导的链置换级联反应，将该邻近门控产生的起始子转换为放大的荧光信号。同时设计了两对荧光基团/猝灭基团配对的底物（S1和S2）以及两条辅助链（A1和A2），使得起始子能够依次打开底物，将荧光基团与淬灭基团分离以释放荧光，并暴露出新的toehold来招募额外的底物。这一催化过程驱动了高度分支化、高分子量的树状DNA纳米结构的原位生长，并随时间产生非线性的信号增益。

当所有组分都存在时，原位PAGE显示了高阶DNA组装的逐步形成（图2b）。与催化链置换设计一致，荧光测量显示出信号的时间依赖性增加和触发剂量依赖性响应（图2c、d、f），而原子力显微镜（AFM）直接观察到分支DNA结构随时间生长的过程（图2e）。

PREDICTOR识别外泌体表面的glycoRNA

为了在单外泌体水平上可视化表面糖基化RNA，首先将纯化后的sEVs固定于醛/硫酸盐乳胶微球上，然后在微球捕获的外泌体上直接进行PREDICTOR反应。扫描电子显微镜证实sEVs在微球表面呈密集覆盖（图3b）。共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）显示，只有当所有PREDICTOR组分均存在时，微球上才能检测到强荧光信号，而缺失关键组分时背景信号极低（图3c、3d）。

为验证信号确实来源于糖基化RNA，而非探针的非特异性吸附，在进行PREDICTOR检测之前，分别对RNA和聚糖部分进行了独立干扰处理。用RNase混合物（RNaseA/T1）预处理完整的sEVs与缓冲液对照组相比，荧光显著降低（图3e,f），表明表面的glycoRNA是必需的。同样，用PNGaseF去除N‑聚糖或用神经氨酸酶裂解末端唾液酸会显著抑制PREDICTOR信号，而O‑糖苷酶则影响甚微（图3e,f）。用kifunensine（一种内质网α-甘露糖苷酶I抑制剂）干扰N-聚糖成熟也能降低信号，这与Neu5Ac适配体识别依赖于唾液酸化N-聚糖特征的结果一致。

对微球捕获的sEVs进行流式细胞术分析，提供了另一种正交检测手段，并佐证了显微成像的结果：与未处理对照组相比，RNase A/T1、PNGase F、神经氨酸酶或kifunensine处理均显著降低了平均荧光强度（图3g）。综上，这些数据表明PREDICTOR能够检测完整sEVs表面的、与唾液酸化N-连接聚糖相连的RNA，并且邻近门控的DNA回路可有效抑制未结合探针产生的背景信号。

为评估PREDICTOR的多功能性，研究还将该方法应用于MCF-10A细胞以检测细胞表面的糖基化RNA（S2）。对MCF-10A细胞进行RNase混合液（A/T1）、NGI-1和PNGase-F处理，随后进行CLSM成像。此外，对同样处理的样品进行流式细胞术分析，进一步证实了这些发现，从而进一步验证了结论。这些结果表明，PREDICTOR可用于高灵敏度、高选择性的糖基化RNA原位成像。

为了对PREDICTOR与具有代表性的糖基化RNA扩增工作流程进行定量比较，在相同条件下使用一系列不同浓度的sEVs输入（5×10^3–5×10^9颗粒/毫升），将其与ARPLA和HieCo2进行了对比。在总体荧光测量中，对荧光读数与log10(sEVs浓度)进行回归分析，结果显示PREDICTOR的响应更陡（y = 0.3723x - 0.8453，R² = 0.9846），优于ARPLA（y = 0.3013x - 0.6477，R² = 0.9748）和HieCo2（y = 0.2303x - 0.4030，R² = 0.9663），并且在相同的采集参数下，PREDICTOR产生了更高的终点信号（图S3）。在基于微球的成像中，PREDICTOR同样表现出比ARPLA和HieCo2更陡的log10线性响应（y = 4.1050x - 9.4807，R² = 0.9816），而ARPLA为（y = 3.4951x - 8.5349，R² = 0.9748），HieCo2为（y = 2.7110x - 5.7566，R² = 0.9757）（图S4）。这些基准对比数据凸显了PREDICTOR中无酶、非线性DNA级联反应所实现的增强信号增益。这些结果表明，PREDICTOR不仅可用于灵敏检测，还可用于纳米尺度sEVs及细胞表面上糖基化RNA分布的空间定位。

乳腺癌转化中glycoRNA的丰度

外泌体在生理和疾病中充当短程和远程信使，已成为非侵入性生物标志物的重要来源。鉴于先前报告将细胞表面糖基化RNA与恶性表型相关联，为进一步探究PREDICTOR是否能量化乳腺癌恶性转化系列中的glycoRNA丰度。选择了三种先前报道的glycoRNA候选小RNA（U1 snRNA、SNORD2和U8），并将PREDICTOR应用于来自MCF‐10A（非恶性）、MCF‐7（低恶性）和MDA‐MB‐231（高恶性）细胞的sEVs。

CLSM成像揭示了U1、SNORD2和U8在来自三种细胞系的sEVs上均有易于检测的表面信号（图4a）。定量荧光分析表明，这些表面glycoRNA的丰度随恶性程度（MCF‐10A→MCF‐7→MDA‐MB‐231）依次减少（图4b），这与图1g中的点击标记结果一致。流式细胞术从群体水平独立验证了这些趋势（图4c），支持sEV表面糖基化RNA丰度与乳腺癌恶性程度呈负相关的结论。综合这些结果，证明PREDICTOR可用于分析完整sEVs上特定表面糖基化RNA候选分子，并比较不同生物学条件下的糖基化RNA水平。

表面glycoRNA促进sEVs膜硬度

为了研究glycoRNA水平对sEVs力学特性的影响，并探索sEVs力学特性与乳腺癌恶性转化之间的关系，研究采用AFM来评估sEVs的刚度。鉴于glycoRNA的丰度随着乳腺癌细胞系恶性程度的增加而减少，研究测量了源自不同恶性程度细胞系的sEVs的刚度（图5a）。利用PREDICTOR技术验证了RNase（A/T1）处理的sEVs表面糖基化RNA的缺失，并对PREDICTOR荧光强度进行了统计分析（图5b,c）。通过AFM对sEVs进行纳米压痕测试，获得了探针与sEVs表面相互作用产生的力‑位移曲线，并使用杨氏模量值来表征sEVs的刚度。结果表明，源自MCF‑10A、MCF‑7和MDA‑MB‑231细胞系的sEVs中表面糖基化RNA的缺失导致表面刚度降低。具体而言，随着肿瘤恶性程度的增加，sEVs的表面刚度分别降低了25.08%和54.72%（图5d,e）。这些发现表明，sEVs表面糖基化RNA的缺失导致了这种变软效应，提示表面RNA相关组分能够显著影响sEVs的膜刚度。

表面glycoRNA调节巨噬细胞摄取和炎症激活

为探究表面的glycoRNA是否参与免疫细胞与肿瘤来源sEVs的相互作用，研究评估了巨噬细胞对处理组与对照组sEVs的摄取情况。由于跨物种实验可能干扰受体‑配体相互作用，于是采用同源人类系统，将THP‑1单核细胞分化为M0巨噬细胞，并与PKH26标记的MCF‑7来源sEVs孵育（图6a）。通过CLSM和流式细胞术评估发现，酶法（RNase A/T1）去除表面RNA或去除唾液酸化N-聚糖特征（PNGase F或神经氨酸酶）均显著降低了sEVs的细胞结合/摄取（图6b–d）。

为评估外泌体摄取的改变是否伴随巨噬细胞活化的变化，研究检测了诱导型一氧化氮合酶（iNOS）作为代表性的促炎标志物。在同一实验条件下，巨噬细胞与表面含有glycoRNA的sEVs共孵育，（与缺失糖基化RNA的对照组相比）会产生更高的iNOS水平（图6e），表明表面糖基化RNA/聚糖特征能够调节巨噬细胞反应。然而，对相关受体及摄取途径的最终确定仍需专门的机制研究。