心肌缺血再灌注（I/R）损伤是全球致残、致死的主要原因之一，但其深层发病机制长期未明。尽管环状RNA（circRNA）在心脏发育与疾病中的调控作用逐渐被认识，它们在心肌I/R损伤中的具体角色仍待深入挖掘。

近日，哈尔滨医科大学杨宝峰院士团队在 《Signal Transduction and Targeted Therapy》（IF=53） 发表了一项关于心肌缺血再灌注（I/R）损伤的重要研究，首次鉴定出一个受m6A修饰调控的环状RNA circArhgap26并首次揭示其受到m6A甲基化修饰的动态调控。机制上，circArhgap26可直接结合PKP1蛋白，干扰其与棕榈酰转移酶ZDHHC1的互作，从而抑制PKP1的棕榈酰化修饰及蛋白稳定性。这项研究将m6A RNA修饰与蛋白质棕榈酰化翻译后修饰两大前沿领域融合，为基于circRNA的治疗开辟了全新方向。

心肌缺血再灌注（I/R）损伤是全球范围内致残和致死的主要原因之一，但其潜在机制仍未知。尽管环状RNA（circRNA）作为心脏发育和疾病的关键调控因子正逐渐被认识，其在心肌I/R损伤中的作用尚未得到深入研究。在本研究中，我们鉴定出一个名为circArhgap26的环状RNA，该RNA受m6A修饰调控。在I/R心肌组织中，circArhgap26的表达显著降低。心肌特异性过表达circArhgap26可改善I/R模型小鼠的心功能障碍，减少梗死面积及心肌细胞凋亡。机制上，circArhgap26直接与PKP1蛋白结合，从而抑制PKP1与棕榈酰转移酶ZDHHC1之间的相互作用。随后，PKP1的棕榈酰化水平及其蛋白稳定性均下降，导致APAF1蛋白合成减少，并抑制Caspase-9/Caspase-3信号通路，从而减轻心肌细胞凋亡。最为重要的是，在接受经皮冠状动脉介入治疗（PCI）的患者血浆中，circArhgap26的表达同样降低。本研究不仅阐明了circArhgap26通过m6A修饰和翻译后修饰（棕榈酰化）双重调控机制对抗I/R损伤的作用，也为基于circRNA的疗法提供了理论基础。circArhgap26作为预后生物标志物和治疗靶点的双重价值，有望推动精准心血管医学的发展，并改善全球高发的I/R相关疾病的临床结局。

图1. CircArhgap26（一种来源于 Arhgap26 的新型环状 RNA）在 I/R 患者血清、I/R 小鼠心脏组织的梗死边缘区以及 H/R 心肌细胞中表达降低

a、b. 在急性心肌梗死（AMI）小鼠心脏组织和低氧处理的心肌细胞中，circArhgap26 表达显著下降。

c–e. 在缺血再灌注（I/R）小鼠心脏组织、H₂O₂ 处理及缺氧/复氧（H/R）处理的心肌细胞中，circArhgap26 水平同样降低。

f. I/R 模型小鼠血清中的 circArhgap26 表达低于假手术对照组。

g. 接受 PCI 治疗的患者的血浆人源 circArhgap26 水平低于健康志愿者。

h. 结合 Sanger 测序证实 circArhgap26 由 Arhgap26 基因前体 mRNA 通过反向剪接形成。

i. RNase R 处理后，circArhgap26 表达稳定，而线性 Arhgap26 mRNA 显著减少，证明 circArhgap26 具有环状结构。

j. 荧光原位杂交（FISH）显示 circArhgap26 主要分布于心肌细胞胞质中（参考红色信号定位）。

k. 核质分离后 qRTPCR 定量证实 circArhgap26 在胞质中富集，与 FISH 结果一致。

图2：过表达 circArhgap26 可改善心脏缺血性损伤

a. 构建心肌特异性过表达circArhgap26的转基因小鼠（AAV9-CircArhgap26组）及其对照组（AAV9-Vector组）。

b、c. 过表达 circArhgap26 后，超声心动图显示心功能指标 EF 和 FS 显著改善（提示心功能恢复）。

d. 血清 LDH 水平降低，表明心肌细胞损伤减轻。

e. 心脏组织中 Caspase-3 活性下降，提示细胞凋亡受到抑制。

f. 血浆 cTnT（心肌肌钙蛋白 T）水平降低，进一步证实心肌损伤减轻。

g. TUNEL 染色显示心脏组织中凋亡细胞数量减少，即抗凋亡作用。

h. Evans blue/TTC 双染显示心肌梗死面积缩小（未染色区域代表梗死区），说明circArhgap26 具有心脏保护作用。

i. Western blot 结果显示，促凋亡蛋白 Bax 表达下调，抗凋亡蛋白 Bcl2 表达上调，从分子层面解释了抗凋亡机制。

图3： PKP1鉴定为 circArhgap26 相关蛋白

a. 通过功能聚类分析，对 circArhgap26 下拉的蛋白进行整体功能分类。

b. RIP 实验证实，在心肌细胞中 PKP1 与 circArhgap26 存在特异性相互作用（相对于 IgG 对照）。

c. LC‒MS/MS 质谱鉴定出了代表性的 PKP1 肽段，为蛋白身份提供直接证据。

d. 在 H₂O₂ 处理的心肌细胞中，PKP1 的 mRNA 和蛋白水平均发生变化。

e. I/R 手术后心脏组织中 PKP1 的 mRNA 和蛋白水平同样发生改变，提示其在缺血再灌注损伤中可能发挥作用。

f. circArhgap26 Pull-down 联合 Western blot 进一步验证了 circArhgap26 与 PKP1 之间的直接或间接结合。

g. 分子结构图显示 circArhgap26与 PKP1 的关键氨基酸残基的结合模式。

h. FISH与 IF共染色显示两者在心肌细胞中存在共定位，支持胞内相互作用。

i. 示意图展示了全长 PKP1 及不同截短型 PKP1 的构造。

j. RIP 实验结合 qRTPCR 表明，PKP1 与 circArhgap26 的结合依赖于 PKP1 的特定结构域。

图4：抑制 PKP1 可改善缺血/再灌注（I/R）诱导的心脏损伤

a. 实验设计的流程示意图（使用 AAV9-Sh-PKP1 敲低 PKP1）。

b, c. 抑制 PKP1 后，超声心动图显示心功能指标 EF 和 FS 显著改善，表明心脏功能恢复。

d. 血清 LDH 水平降低，说明心肌细胞死亡减少。

e. 心脏组织中 Caspase-3 活性下降，提示细胞凋亡受到抑制。

f. TUNEL 染色显示心脏组织中凋亡细胞数量减少，进一步证实抗凋亡作用。

g. Evans blue/TTC双染显示心肌梗死面积缩小（未染色区域代表梗死区），说明抑制 PKP1 具有心脏保护作用。

h. Western blot 结果显示，促凋亡蛋白 Bax 表达下调，抗凋亡蛋白 Bcl2 表达上调，从分子层面解释了抑制 PKP1 减轻 I/R 损伤的机制。

为探究PKP1过表达对I/R损伤的影响，研究团队构建了心肌特异性过表达PKP1的AAV9小鼠模型。结果显示，过表达PKP1进一步恶化了I/R引起的心功能障碍（射血分数和短轴缩短率进一步下降、左心室进一步扩大），同时加剧了心肌细胞损伤（LDH和Caspase-3活性升高）、细胞凋亡增多、梗死面积扩大，并进一步上调Bax、下调Bcl2。在H₂O₂处理的心肌细胞中，过表达PKP1同样降低了细胞活力，增加了LDH释放、Caspase-3活性和细胞凋亡，并导致Bax/Bcl2表达失衡。相反，敲低PKP1（体外siRNA）则能有效缓解H₂O₂诱导的上述损伤效应。这些结果从正反两方面验证了PKP1在心肌I/R损伤中的促损伤作用。

图5：过表达 PKP1 会影响 I/R 诱导的心脏损伤中 circArhgap26 的上调

a. 提供了病毒注射及心肌 I/R 模型建立的实验流程示意图（包括对照组、I/R 组、I/R+circArhgap26 组、I/R+circArhgap26+PKP1 过表达组等）。

b, c. 过表达 PKP1 会抵消 circArhgap26 对心功能的保护作用，与单纯过表达 circArhgap26 组相比表现为 EF 和 FS 显著下降。

d. PKP1 过表达使血清 LDH 水平回升，表明心肌细胞损伤加重。

e. PKP1 过表达逆转了 circArhgap26 对 Caspase-3 活性的抑制作用，使凋亡活性再次升高。

f. TUNEL 染色显示，在 circArhgap26 基础上过表达 PKP1 导致凋亡细胞数量显著增加。

g. Evans blue/TTC 双染显示，过表达 PKP1 使 circArhgap26 缩小的梗死面积再次扩大。

h. Western blot 结果显示，PKP1 过表达阻断了 circArhgap26 下调 Bax 和上调 Bcl2 的作用，从分子水平证实 PKP1 可拮抗 circArhgap26 的抗凋亡效应。

图6：CircArhgap26 通过抑制 PKP1 的棕榈酰化来降低其蛋白稳定性

a, b. 过表达 circArhgap26 可降低 PKP1 的 mRNA 和蛋白水平，而敲低 circArhgap26 则上调 PKP1，表明 circArhgap26 负向调控 PKP1 表达。

c. CHX 追踪实验显示，过表达 circArhgap26 加速 PKP1 蛋白降解（半衰期缩短），证明 circArhgap26 降低 PKP1 的蛋白稳定性。

d. 微阵列芯片结果的功能聚类分析揭示了 circArhgap26 可能参与调控的相关通路或功能簇。

e. 棕榈酰化抑制剂 2-BP 呈剂量依赖性降低 PKP1 蛋白表达，提示棕榈酰化对维持 PKP1 稳定性至关重要。

f. 2-BP 处理直接降低了 PKP1 的棕榈酰化水平，验证了抑制剂的有效性。

g. CHX 追踪实验表明，2-BP 处理加速 PKP1 降解，说明棕榈酰化修饰可增强 PKP1 的蛋白稳定性。

h. 过表达 circArhgap26 显著降低 PKP1 的棕榈酰化水平，直接证明 circArhgap26 通过抑制 PKP1 棕榈酰化来降低其蛋白稳定性。

图7：CircArhgap26 竞争性结合 PKP1，并抑制 ZDHHC1 介导的棕榈酰化

a. 通过 ABE 实验（检测棕榈酰化的经典方法）结合 western blot，评估 circArhgap26 对 PKP1 棕榈酰化水平的影响。

b. CHX 追踪实验显示，敲低 ZDHHC1 可加速 PKP1 蛋白降解，表明 ZDHHC1 参与维持 PKP1 稳定性。

c. 免疫共沉淀（co-IP）实验证实 ZDHHC1 与 PKP1 之间存在直接或间接的相互作用。

d. co-IP 实验进一步表明，circArhgap26 可削弱 PKP1 与 ZDHHC1 之间的结合（竞争性抑制作用）。

e. 分子对接模拟验证了 PKP1 与 ZDHHC1 的蛋白-蛋白相互作用模式。

f. co-IP 实验定位显示 ZDHHC1 与 PKP1 的 ARM1 结构域相结合。

g, h. ABE 实验直接证明 circArhgap26 降低 PKP1 的棕榈酰化水平，而 ZDHHC1 敲低也有类似效果。

i. CHX 追踪实验显示，PKP1 的棕榈酰化位点突变体（C14S/C136S）蛋白稳定性下降，证明这两个半胱氨酸位点是棕榈酰化修饰的关键残基。

j. ABE 实验进一步证实，circArhgap26 通过抑制 ZDHHC1 介导的棕榈酰化来降低 PKP1 的棕榈酰化水平。

图8：PKP1 通过结合 APAF1 mRNA 的 5′ UTR 来增强 APAF1 蛋白合成

a. 通过 GO 和 KEGG 富集分析（基于 STRING 数据库，使用 Metascape 工具）预测 PKP1 的可能功能及参与的信号通路。

b. 敲低 PKP1 后，APAF1 蛋白表达水平显著下降（Western blot 结果）。

c. 敲低 PKP1 对 APAF1 mRNA 水平影响较小或无显著变化（qRTPCR 结果），提示 PKP1 主要在翻译层面调控 APAF1。

d. CHX 追踪实验显示，敲低 PKP1 不改变 APAF1 蛋白降解速率（半衰期相近），说明 PKP1 不影响 APAF1 的蛋白稳定性。

e. 荧光素酶报告基因实验证明 PKP1 可增强 APAF1 的翻译效率（通过 5′ UTR 区域）。

f. 多聚核糖体分析显示，敲低 PKP1 改变了 APAF1 mRNA 与核糖体的结合状态。

g. 定量分析表明，敲低 PKP1 后，APAF1 mRNA 在重多聚核糖体部分的分布减少，在非核糖体部分的分布增加，证实 PKP1 促进 APAF1 mRNA 的翻译起始或延伸。

h, i. 敲低 PKP1 后，cleaved caspase-9/caspase-9 比值和 cleaved caspase-3 水平均下降，表明 PKP1 通过上调 APAF1 翻译进而激活下游凋亡通路。

附图：m6A 修饰对 circArhgap26 在心肌细胞中表达的调控

(a). 通过 SRAMP 在线预测工具，发现 circArhgap26 序列上存在潜在的 m6A 修饰位点。

(b). MeRIP 实验证实，circArhgap26 可被 m6A 抗体特异性富集，表明其确实存在 m6A 修饰。

(c). RIPSeq 数据库预测 circArhgap26 与 m6A 阅读蛋白 YTHDF2 之间存在相互作用。

(d). RIP 实验验证 YTHDF2 抗体能够富集 circArhgap26，说明两者在细胞内结合。

(e). 敲低 YTHDF2（si-YTHDF2）可有效降低 YTHDF2 的 mRNA 表达水平（与 si-NC 对照相比）。

(f-g). 改变 YTHDF2 表达水平（过表达或敲低）会影响 circArhgap26 的表达量，表明 YTHDF2 通过识别 m6A 修饰参与调控 circArhgap26 的稳定性或代谢。

• 关键分子：

  circArhgap26（受m6A修饰调控）在I/R损伤及PCI患者血浆中显著下调。心肌过表达circArhgap26改善心功能、缩小心梗面积、减少心肌凋亡。

• 机制核心：

  circArhgap26/PKP1/APAF1/Caspase-9/Caspase-3 信号轴circArhgap26竞争性抑制ZDHHC1介导的PKP1棕榈酰化，降低PKP1稳定性，进而减少APAF1翻译，阻断Caspase-9/3凋亡通路。

• 创新调控发现：

  首次发现circRNA通过竞争棕榈酰化位点调控蛋白稳定性，拓展非编码RNA功能认知。

• 临床价值：

  PCI患者血浆中hcircArhgap26显著降低，可作为无创预后生物标志物；circArhgap26高度保守（与人类同源性91.65%），，小鼠研究结果有望转化至人类，兼具治疗靶点潜力。

• 上下游机制：

  上游：m6A阅读蛋白YTHDF2促进circArhgap26降解。

  下游：PKP1结合APAF1 mRNA 5′UTR，增强其翻译启动。

• 研究意义：

  为缺血性心脏病提供了全新的RNA治疗候选分子，对其它缺血相关疾病也具有潜在借鉴意义。

产品1：m6A MeRIP-Seq (spike in plus)测序技术

m6A MeRIP-Seq（Methylated RNA Immunoprecipitation，MeRIP）是研究转录组表观修饰的关键技术，基于m6A修饰抗体特异性识别并结合m6A修饰RNA的原理，以免疫共沉淀方法富集RNA片段，并配合高通量测序技术，实现转录组范围内甲基化的RNA区域的检测。MeRIP测序技术技术成熟、适用于各类分子(mRNA,LncRNA,circRNA,pri-miRNA等)。云序生物通过添加Spike-In实现更加准确的m6A检测。常规的MeRIP实验通过修饰抗体富集修饰RNA，众所周知，抗体特异性的强弱是决定MeRIP实验是否成功的关键，没有Spike-In，将难以确定实验是否成功、有效RNA是否富集，也难以确定RNA甲基化修饰的丰度和变化，那么就无法保证测序结果真实可靠、质量达标。

产品2：circRNA-Seq(UDI+UMI+Spike-in+链特异性建库）

环状RNA(circularRNA，circRNA)是新发现的一类新型非编码RNA分子，其在真核细胞中的大量存在颠覆了传统的线性RNA观点，成为近两年来RNA领域中迅速升起的一颗新星。环状RNA的表达具有组织和疾病特异性，与组织发育、疾病的发生发展密切相关。此外，环状RNA不易降解，能在血浆、唾液等体液中稳定存在，可以作为新型疾病分子标志物。云序生物提供的环状RNA测序服务覆盖几乎全部已知物种，独家的Cloudseq® CircRNA Enrichment Kit，能高效率纯化环状RNA，帮助客户以较低的样本检测到更多的环状RNA。

产品3：RNA Pull-down技术

RNA Pull-down是一种用于研究RNA-蛋白质相互作用的实验技术，广泛应用于基因表达调控研究。该技术通过生物素标记的RNA探针与细胞裂解液孵育，形成RNA-蛋白质复合物，再利用链霉亲和素标记的磁珠分离复合物。纯化产物可依据研究目的分别处理:若关注结合蛋白，可直接进行Western blot或质谱鉴定;若关注RNA互作网络，则使用Trizol提取RNA后进行测序分析，实现对RNA及蛋白质靶标的精准解析。

产品4：Polysome profiling多聚核糖体测序

核糖体是细胞内部密度最大的生物大分子，结合有不同数量核糖体的mRNA其沉降速率也不同。多聚核糖体测序（polysome profiling）通过蔗糖密度梯度超速离心的方法，将与多个核糖体结合的全长mRNA进行富集并测序。实验原理是：由于mRNA与核糖体结合形成复合物后，分子量会提高。且单条mRNA结合的核糖体越多，复合物的分子量越大。通常一条mRNA模版可以同时结合多个核糖体，从而并行合成多个蛋白分子，因此正在翻译的mRNA分子会与多个核糖体形成多聚核糖体复合物（Polysomes），通常会悬浮在高密度的蔗糖溶液层中。从高密度的蔗糖溶液层中，就可以分离正在翻译的mRNA分子。因此，多聚核糖体测序富集的第一步，是得到全长的与核糖体结合的mRNA分子。后续的实验步骤则与RNA-Seq完全相同，结果与RNA-Seq也极为相似。