往期回顾

新生RNA研究“三重奏”：云序SLAM-seq、GRO-seq与PRO-seq，精准锁定RNA的“新生瞬间”

SLAM-seq客户文章：云序用户NAR (lF 16.6)：上海交通大学医学院余健秀团队揭秘NEXT和PRC2互作调控H3K27me3水平

caRNA/carRNA-Seq：caRNA/carRNA测序（caRNA-Seq/carRNA-Seq）技术

SLAM-Seq：新生转录本测序（Slam-seq）技术

rGRO-Seq：微量GRO测序（rGRO-seq）技术

rPRO-Seq：微量PRO测序（rPRO-seq）技术

新生RNA综述

新生RNA（nascent RNA）是指在细胞核内，由RNA聚合酶以DNA为模板新合成，且尚未经历后期加工的原始RNA转录本。与成熟的、进入细胞质的mRNA相比，新生RNA具有几个显著特征：

1) 瞬时性与不稳定：许多新生RNA合成后很快就会被加工或降解，寿命很短，这使其成为研究转录活动的关键；

2) 包含内含子：新生RNA保留了基因的完整序列信息，包括成熟mRNA中的外显子与随后通过剪接去除的内含子；

3) 位于细胞核内：“新合成”且未成熟的新生RNA主要存在于细胞核中。

在真核生物中，RNA聚合酶I（Pol I）与RNA聚合酶III（Pol III）分别负责核糖体RNA（rRNA）及多种小型结构RNA的合成；而RNA聚合酶II（Pol II）则负责转录产生信使RNA（mRNA）、长链非编码RNA（lncRNA）、初级microRNA以及增强子RNA（eRNA）。尽管同一个体的所有体细胞携带完全相同的基因组，但基因表达调控决定了RNA与蛋白质的表达水平。因此，全基因组范围内的转录协同调控是细胞分化、响应胞内/胞外信号以及机体执行各项生理功能的基础。

转录是一个受精密调控的多步骤过程，主要包括以下阶段：

1. 染色质开放：转录起始于先锋转录因子结合处于闭合状态的染色质，并通过招募核小体重塑因子与组蛋白乙酰转移酶提升染色质可及性。

2. 转录前起始复合物（PIC）组装：随着染色质结构开放，DNA上的顺式调控元件得以被更多转录因子识别结合，并在此基础上组装转录前起始复合物。

3. 转录起始：PIC组装完成后，其TFIIH亚基可解旋双链DNA，使Pol II进入转录起始状态，开始合成RNA。

4. 启动子近端暂停：进入延伸状态的Pol II最初转录20–60个核苷酸后，便会进入启动子近端暂停阶段。在哺乳动物及多数后生动物中，这是基因表达的主要限速步骤，也是转录调控的关键检查点。在早期转录过程中，新生RNA的5′端会发生加帽修饰，使其免受核酸酶降解。

5. 暂停释放：暂停释放需要P‑TEFb的激活，其CDK9亚基可磷酸化NELF‑E、DSIF以及Pol II CTD的Ser2位点，使Pol II脱离暂停进入高效延伸。

6. 高效延伸与共转录加工：在高效延伸阶段，多种延伸因子协同作用，使Pol II高效合成RNA，并将新生RNA的加工过程（如剪接）与转录紧密偶联。

7. 转录终止与聚合酶回收：当Pol II到达基因3′端时，转录本被切割并发生多聚腺苷酸化，前体mRNA从Pol II上释放，未加帽的新生RNA暴露于XRN2核酸外切酶介导的降解途径中，促使Pol II失稳并从DNA模板上解离。解离后的Pol II可被循环利用，进入下一轮转录。

转录周期

从细胞总RNA中富集新生或新合成的RNA，是研究RNA合成过程的关键策略。目前所有相关技术的基本流程大致相同：首先对分离得到的转录本进行逆转录、连接接头、高通量测序，再将测序读段比对至参考基因组，从而获得全基因组范围的新生RNA测序数据。尽管多数RNA测序方法在文库制备和数据分析步骤上具有共性，但不同方法在富集新生RNA的能力上存在显著差异，所选技术决定了能够分析的RNA种类或转录周期的具体阶段，也直接影响所获数据的灵敏度与分辨率。

目前富集新生RNA的主要策略包括：分离染色质结合RNA、与Pol II结合的RNA、带帽小RNA、新合成RNA，或来自具有延伸能力的Pol II复合物的RNA。多数方法能够可靠地检测基因表达的变化，但在识别不同转录步骤的敏感性、时空分辨率以及鉴定特定RNA种类（如eRNA、未剪接中间体及其他不稳定非编码RNA）的能力上，存在明显差异，需根据研究目标精准选择。

新生RNA富集及测序技术

1. 染色质结合RNA分离法（caRNA-Seq/Start-Seq）

caRNA-Seq原理是利用高盐洗脱，将存在于染色质上的RNA（即caRNA，染色质结合RNA）与细胞中其他RNA分离，利用分级分离过程中新生转录本与聚合酶的稳定结合特性，实现新生RNA的初步富集。由于细胞质和细胞核质中的成熟RNA，在丰度和稳定性上均显著高于新生RNA，通过富集caRNA，可显著提高检测基因和增强子转录变化的动态范围。但该方法存在一定局限性：部分成熟RNA（如Xist lncRNA、剪接体snRNA等）也会与染色质稳定结合，会被一同捕获，影响新生RNA检测的特异性。

Start-Seq通过富集染色质结合的带帽RNA实现目标捕获：利用酶解作用降解未被5′帽结构保护的caRNA，并筛选长度小于80 nt的带帽caRNA，进一步富集处于转录起始、暂停或早期延伸阶段的转录本。这些短链带帽RNA可同时提供TSS与转录活性位点的信息，覆盖基因编码区与增强子区域，为转录起始阶段的调控研究提供有力支撑。

2. 分离与Pol II结合的RNA（NET-Seq/mNET-Seq）

NET-Seq（Nascent Elongating Transcript Sequencing）通过免疫沉淀富集与Pol II结合的RNA，可有效去除大部分非新生RNA及Pol I、Pol III相关转录本。适用于哺乳动物细胞的NET-seq（mNET-seq），通过使用识别Pol II不同翻译后修饰C端结构域的抗体，可以鉴定基因不同区域转录复合物的调控状态，为解析Pol II的调控机制提供重要依据。

3. 分离具有转录能力的Pol II相关RNA（GRO-Seq、PRO-Seq）

GRO-Seq、PRO-Seq是基于核转录延伸（Nuclear Run-On, NRO）原理建立的新生RNA测序技术，可特异性捕获正在合成的RNA，是目前新生RNA研究中最常用、最精准的方法。其核心流程为：提取细胞核并迅速将其冷冻，使转录过程停滞，随后在转录恢复阶段加入标记的核苷三磷酸，使新合成的RNA分子带上标记，从而捕获新生RNA。

GRO-Seq是首个适配全基因组研究的核转录延伸方法，采用5-溴尿苷三磷酸（BrUTP）标记新生转录本，并用抗BrUTP抗体进行免疫纯化。可全面捕获全基因组范围内的活跃转录信号，精准反映全局转录活性，是鉴定活性增强子、分析全局转录变化的核心工具。

PRO-Seq在此基础上进一步优化，实现了单核苷酸分辨率的活性转录图谱绘制。在PRO-seq中，生物素标记的NTP（bio-11-NTPs）被掺入到具有转录能力的Pol II活性位点，由于空间位阻效应，通常每个活性位点仅能掺入一个核苷酸。若同时使用四种生物素化NTP，其掺入效率相近，可无偏好性地捕获所有转录本。Run-On反应后，使用链霉亲和素磁珠分离生物素标记的新生转录本，从而获得单核苷酸分辨率下转录活性位点的分布图谱。

对于不易进行细胞核分离或样品在储存过程中存在RNA降解的组织样本，研究人员开发了染色质运行测序（ChRO-Seq），该方法直接以染色质为起始材料进行运行反应，从而捕获新生RNA。除此之外，GRO-Seq和PRO-Seq均已衍生出用于单核苷酸分辨率鉴定转录起始位点的技术，即GRO-cap和PRO-cap，其原理与Start-Seq类似，利用酶解作用降解未被5′帽结构保护的RNA，从而捕获带帽的新生RNA。

4. 分离代谢标记RNA（TT-seq/SLAM-Seq/TimeLapse-Seq）

代谢标记法的核心是：细胞在含有修饰核苷如4-硫代尿苷（S4U）、溴尿苷（BrU）或5-乙烯基尿苷（EU）的培养基中生长，这些核苷可透过细胞膜，被处于活跃状态的RNA聚合酶掺入新生RNA中，从而实现新生RNA的特异性标记。

TT-Seq（Transient Transcriptome sequencing）缩短S4U标记时间至5分钟，以此提高对新合成RNA的检测能力。在TT-Seq中，通过超声破碎将RNA片段化，再经免疫或亲和纯化富集代谢标记的RNA，将其与未标记RNA或总RNA进行对比分析，从而检测新合成RNA的整体水平。

SLAM-Seq和TimeLapse-Seq是通过化学处理将掺入的S4U转化为胞嘧啶（C），在测序后产生单核苷酸突变，通过突变频率定量新生RNA水平。该方法无需物理分离标记RNA，可在同一份样本中同时比较新生RNA与背景RNA，结合背景校正，可实现全基因组范围内RNA合成速率与降解速率的估算。除培养细胞外，代谢标记也已成功应用于活体动物。代谢标记虽无法实现单核苷酸分辨率的RNA合成追踪，但能够在活细胞中测量RNA合成，从而研究RNA的寿命与周转规律。

5. 各类新生RNA研究方法的优势与局限总结

每种新生RNA测量方法都具有独特的优势和局限。传统RNA-Seq能可靠检测成熟mRNA的稳态水平，但只有新生RNA测序技术能精准定量RNA合成变化、捕获不稳定RNA（如eRNA），为转录调控研究提供更直接的证据。

不同新生RNA技术针对转录调控与共转录过程的不同科学问题设计，联合分析多种方法的研究结果，可全面揭示基因调控的多个阶段。在各类新生RNA测序方法中，PRO-Seq可直接定位全基因组范围内转录复合物（Pol II）的位置，为Pol II调控机制的深度研究提供了核心工具；代谢标记技术（如SLAM-Seq）则主要用于测量单位时间内RNA的合成量，适合RNA半衰期与代谢相关研究；GRO-Seq在体外转录过程中可产生较长的转录本，从而显著提高短转录本及基因组重复区域来源转录本的比对效率，更适合全局转录活性与增强子活性的全景分析。

不同新生RNA研究方法对比：

Pol II在转录不同步骤的机制性调控，决定了单个基因的表达水平，并协同调控整体转录程序。目前，新生RNA研究方法加深了科研人员对转录步骤的机制调控与伴随发生的 RNA 加工过程的理解：

• 转录的两大核心限速步骤：过去人们认为，转录的关键在于RNA聚合酶被 “招募”到基因上。而随着新生RNA技术的发展，研究者发现：真核生物转录真正的限速步骤，是启动子近端暂停与暂停释放。几乎所有活跃基因都会经历 Pol II 在启动子附近的短暂停留，这一步是细胞快速、精准调控转录的核心开关。

• 启动子近端暂停：转录的“待命”状态：启动子近端暂停是转录周期中极为关键的调控节点：Pol II起始转录后，只合成20～60 nt便停止不前，处于“待命”状态。这种模式让基因能在信号刺激时瞬间启动快速表达，无需从头组装转录机器，是发育、应激、免疫等快速响应程序的分子基础。进一步研究表明：新一轮起始必须等待已启动的Pol II 完成暂停释放，这提示启动子近端暂停会阻止新一轮转录起始。

• 增强子也有转录，也会暂停：增强子不只是“开关”，它自身也会被转录，产生增强子RNA（eRNA）。利用新生RNA测序技术发现：增强子上同样存在Pol II 暂停，并且双向转录是鉴定活性增强子的重要标志。增强子与启动子的转录调控高度相似，共同决定基因何时表达、表达多少。

• 转录以“爆发”形式进行：单细胞研究显示，基因转录不是连续平稳的，而是以不连续的“爆发”形式进行。最新研究证明：爆发的触发关键不是 Pol II 招募，而是暂停释放。这也正是新生RNA技术（GRO‑Seq / PRO‑Seq）比普通 RNA‑Seq 更能反映真实转录状态的原因。

启动子近端暂停会干扰转录起始

Pol II从启动子近端暂停释放并进入延伸阶段，仅仅是一个开始：5’端加帽、内含子剪接、多聚腺苷酸化、RNA编辑、RNA甲基化等共转录过程，不仅对维持高效转录至关重要，也决定了RNA的稳定性与转运。

• 5’加帽：该过程发生在Pol II启动子近端暂停之前或暂停期间。当RNA刚合成几十个核苷酸，其5′端便完成加帽。5′帽子结构可保护RNA免受核酸酶降解，促进RNA核输出并提升翻译效率。

• 边转录边剪接：多数组成型剪接在转录过程中即完成，而可变剪接则更多发生在转录之后。研究表明，多数RNA在剪接完成前始终与染色质结合，提示染色质微环境能够促进剪接的高效进行。

• RNA修饰：RNA修饰与RNA编辑同样以共转录的方式发生。m6A修饰在转录起始后迅速建立；RNA编辑在RNA刚合成几十个核苷酸内就完成；这些修饰可调控剪接效率、RNA稳定性与翻译活性，是转录调控的重要组成部分。

云序生物新生RNA研究策略

1. 产品简介

微量PRO测序（rapid precision nuclear run-on sequencing, rPRO-Seq）是PRO-Seq的升级版本。在保持单碱基分辨率优势的同时，实现更低的样本投入与更高效稳定的建库性能：

• 微量：起始样本量仅需大于 5×10^5个细胞，大幅降低样本损耗，适用于原代细胞、分选细胞等细胞数量有限的样本类型。

• 快速：优化后的实验流程显著缩短周期，减少技术波动，提升数据的一致性与可重复性。

• 接头优化：采用5′端预先腺苷酸化的3′接头，有效降低非特异性连接产物，提高文库构建的准确性。

• 引物二聚体少：引入二聚体阻断寡核苷酸（DBO），DBO可与体系中游离3′接头杂交，封闭其连接活性，避免后续5′接头连接过程中形成接头二聚体，大幅提升文库构建效率与数据质量。

2. 技术原理

PRO-Seq核心原理是在转录恢复阶段向反应体系中加入生物素标记的核苷酸（bio-NTP），解除PolⅡ的转录暂停状态，重新启动转录延伸；由于生物素分子具有较大的空间位阻，PolⅡ仅能掺入一个生物素标记的核苷酸后即终止延伸，从而将生物素标记精确锁定于新生RNA链的3’末端。rPRO-Seq在实验流程、文库构建等关键环节进行了优化。

rPRO-Seq实验流程

3. 产品优势

样本需求量低

rPRO-Seq通过优化实验流程与文库构建方案，大幅提升文库构建效率、降低样本损失，起始样本量需求低，适配原代细胞、分选细胞、微量组织等细胞数量有限的样本类型。

流程快速，结果稳定

rPRO-Seq在保持PRO-seq单碱基分辨率优势的同时，对实验流程进行了系统性优化。整体实验周期显著缩短，有效降低了操作过程中引入的技术波动，提升了数据的一致性与可重复性。

接头优化——提升连接特异性与文库质量

rPRO-Seq采用5′ 端预先腺苷酸化活化的3′ 接头，该接头无需额外ATP参与即可直接与RNA 3′ 末端发生连接反应，避免了非特异性连接副产物的形成，显著提升了连接反应的特异性与效率。

引物二聚体显著减少

rPRO-Seq引入二聚体阻断寡核苷酸（DBO），该寡核苷酸可与体系中未参与反应的游离3′ 接头特异性杂交，封闭其连接活性，有效阻断接头二聚体的形成。该策略大幅降低了引物二聚体比例，数据质量高。

单碱基分辨率

rPRO-Seq每个测序reads的最后一个碱基都精确对应Pol Ⅱ的位置。这对于研究转录起始位点（TSS）、Pol Ⅱ在启动子近端的精确暂停位点等至关重要。

1.产品简介

传统GRO-Seq实验流程复杂、样品需求量大，一定程度上限制了其在微量样本中的应用。针对上述局限，云序生物对技术进行全面升级，推出微量GRO测序（rapid Global Run-on sequencing, rGRO-Seq）产品，实现更低的样本投入与更高效稳定的建库性能：

• 微量：起始样本量仅需大于 5×10^5个细胞，大幅降低样本损耗，适用于原代细胞、分选细胞等细胞数量有限的样本类型。

• 快速：优化后的实验流程显著缩短周期，减少技术波动，提升数据的一致性与可重复性。

• 接头优化：采用5′端预先腺苷酸化的3′接头，有效降低非特异性连接产物，提高文库构建的准确性。

• 引物二聚体少：引入二聚体阻断寡核苷酸（DBO），DBO可与体系中游离3′接头杂交，封闭其连接活性，避免后续5′接头连接过程中形成接头二聚体，大幅提升文库构建效率与数据质量。

   

2. 技术原理

微量GRO测序基于经典核转录延伸（Run-On）技术升级优化，是适配微量样本的新生RNA测序技术。该技术在转录恢复阶段加入5-溴尿苷（BrU），新生RNA链在延伸过程中会特异性掺入BrU，便于后续的分离和识别。

微量GRO-Seq实验流程

3. 产品优势

• 样本需求量低

微量GRO-Seq通过优化实验流程与文库构建方案，大幅提升文库构建效率、降低样本损失，起始样本量需求低，适配原代细胞、分选细胞、微量组织等细胞数量有限的样本类型。

• 流程快速，结果稳定

rGRO-Seq对实验流程进行了系统性优化。整体实验周期显著缩短，有效降低了操作过程中引入的技术波动，提升了数据的一致性与可重复性。

• 接头优化——提升连接特异性与文库质量

rGRO-Seq采用5′ 端预先腺苷酸化活化的3′ 接头，该接头无需额外ATP参与即可直接与RNA 3′ 末端发生连接反应，避免了非特异性连接副产物的形成，显著提升了连接反应的特异性与效率。

• 引物二聚体显著减少

rGRO-Seq引入二聚体阻断寡核苷酸（DBO），DBO可与体系中未参与反应的游离3′ 接头特异性杂交，封闭其连接活性，有效阻断接头二聚体的形成。该策略大幅降低了引物二聚体比例，数据质量高。

1. 产品简介

SLAM-Seq（thiol(SH)-Linked Alkylation for the Metabolic sequencing of RNA）全称为“硫醇链接烷基化RNA代谢测序技术”，它通过一种名为4-硫尿苷（S4U）的核苷酸类似物标记RNA，结合高通量测序，从而在总RNA中有效区分并定量“新合成”与“原有”的RNA分子。同时，SLAM-Seq还可用于评估RNA的半衰期与稳定性，鉴定RNA修饰所介导的靶基因变化，揭示影响mRNA稳定性的关键因素。

2. 技术原理

首先，在细胞培养过程中加入S4U，它会随着转录过程被整合到新合成的RNA链中，而细胞中已有的旧RNA则不含S4U。随后，加入碘乙酰胺（IAA）进行处理。IAA会特异性地与新生RNA中的S4U残基发生烷基化反应。该修饰在后续的逆转录过程中，会导致原本对应S4U的位置在测序结果中由T（胸腺嘧啶）被读为C（胞嘧啶），即发生T>C的“碱基转换”。这些T>C转换位点就成了新生RNA的“标签”。通过统计T>C转换的比例，我们就能精确定量新合成RNA，并计算出每个转录本的合成与降解速率，实现对RNA代谢动态的精准解析。

SLAM-seq实验流程

3. 产品优势

应用领域广：Slam-Seq技术不仅能定量分析新生转录本，还能检测RNA半衰期及稳定性变化。

1. 产品简介

caRNA/carRNA(Chromatin-associated RNA，染色质相关RNA)是指能够直接或间接地与染色质相互作用、并具有潜在调控能力的RNA。caRNA-Seq富集所有染色质相关RNA进行高通量测序，专门用于研究caRNA的表达图谱。该技术能够全面分析caRNA，获取其详细的分子特征，从而深入了解caRNA在基因表达调控中所发挥的复杂作用。云序生物也推出caRNA修饰测序，全方位解析caRNA的分子功能。这些信息对于深入理解caRNA在癌症等染色体不稳定性疾病中的功能至关重要，为发现新的诊断标志物和治疗靶点提供实验数据支持。

2. 技术原理

caRNA-Seq技术原理：caRNA-Seq技术的核心在于富集与染色质相互作用的RNA。大体流程如下：

1）富集细胞核：收集细胞并用冷PBS/EDTA洗涤。裂解细胞后，将裂解产物铺于蔗糖垫层上，通过高速离心分离细胞质（上清）和细胞核（沉淀）

2）富集染色质相关组分：细胞核沉淀经PBS/EDTA洗涤后，用甘油缓冲液重悬。加入核裂解缓冲液剧烈震荡裂解核膜，冰浴后离心分离得到染色体相关组分。

3）提取caRNA：从富集的染色质相关组分中提取RNA，包括eRNA、paRNA、cenRNA等各类与染色质直接或间接结合的RNA。

4）构建测序文库：采用去除核糖体的建库方式构建测序文库。

5）高通量测序：利用高通量测序技术对构建的文库进行测序，以获得caRNA的表达图谱。

caRNA-Seq实验流程

3. 产品优势

• 特异性富集caRNA

与常规转录组测序相比，云序生物caRNA-Seq专注于解析染色质相关RNA（caRNA）的表达图谱。该技术通过全面分析caRNA，深度揭示其在基因表达调控中的复杂作用机制，精准满足研究caRNA的客户需求。

• 优化的实验流程

云序生物caRNA-Seq采用与cell文献相同的实验方法，经过精心优化的实验流程，确保了染色质相关组分的高效富集，从而保障了数据的高质量输出。

新生RNA作为基因转录的直接产物，承载着转录调控的原始动态信息，是解析基因表达调控机制、挖掘疾病分子靶点的核心突破口。不同于传统RNA-seq仅能捕捉成熟RNA的静态结果，新生RNA测序技术可精准捕获新生RNA的表达情况，解析Pol II招募、启动子近端暂停与释放等关键环节，为转录调控研究提供更直接、更精准的证据。云序生物重磅推出四款新生RNA测序产品，精准破解科研难题。

微量PRO测序（rPRO-Seq）保留PRO-Seq单碱基分辨率核心优势，起始样本仅需5×10^5个细胞，适配原代细胞、分选细胞等珍稀样本，可精准定位Pol II活性位点，助力转录动力学的高精度研究；

微量GRO测序（rGRO-Seq）优化后同样实现微量样本适配，可全基因组捕获新生RNA信号，高效解析全局转录活性与增强子功能；

SLAM-Seq则通过代谢标记技术，精准区分新合成与原有RNA，可定量RNA合成与降解速率，适配RNA半衰期研究。

caRNA-Seq富集所有染色质相关RNA进行高通量测序，专门用于研究caRNA的表达图谱。

云序生物新生RNA测序产品都能提供一站式解决方案，助力科研人员高效攻克转录调控研究中的关键难题，加速科研成果转化。