生物分子会经历多种化学修饰，这些修饰构成了生物系统动态调控的基础。大量关于不同修饰形式（如糖基化、磷酸化、甲基化和乙酰化）的研究，极大加深了我们对生物分子如何实现功能多样性及其特定亚细胞定位机制的理解。

糖基化是一种关键修饰，在细胞识别、信号转导和免疫应答等生物过程中发挥核心作用。传统观点认为，糖链（glycans）主要连接于蛋白质和脂质。然而，已有研究发现半乳糖和甘露糖单糖可修饰奎诺苷（queuosine，Q），形成半乳糖基奎诺苷（galQ）和甘露糖基奎诺苷（manQ），作为tRNA上的特殊修饰形式。随后，Flynn等人报道，叠氮化物标记的唾液酸可通过代谢方式掺入RNA分子，表明RNA也是此前未被认识的糖基化底物。这一创新性发现催生了一类新的糖基化RNA分子——GlycoRNA。

通过对GlycoRNA转录本的鉴定，研究发现含唾液酸的N-聚糖修饰主要存在于小型非编码RNA中，包括snRNA、rRNA、snoRNA、tRNA和Y RNA。质谱（MS）分析发现，RNA上的糖链相比蛋白质上的糖链更倾向于发生岩藻糖基化或唾液酸化。

在此基础上，研究者开发了适用于RNA的高碘酸氧化与醛连接方法（rPAL）以及修饰核酸的SWATH分析方法（SWAMNA），证明N-聚糖通过修饰碱基acp3U与RNA发生共价连接，为RNA的N-糖基化提供了直接证据。除鉴定与结构表征方面的基础研究外，越来越多的研究表明，GlycoRNA在多种生物过程中发挥重要作用。例如，其参与炎症反应中的细胞迁移与募集；通过与细胞表面凝集素相互作用促进细胞外囊泡（EV）的摄取；以及通过掩蔽具有免疫刺激作用的acp3U维持免疫耐受。因此，阐明GlycoRNA的功能，对于理解其在细胞间通讯、免疫稳态与调控中的作用至关重要。为实现这一目标，亟需建立高效且高灵敏度的分析策略，以全面表征不同细胞类型和物种中RNA所携带的糖链结构。

质谱（MS）结合高效液相色谱（HPLC）等分离技术，具备异构体分离、精确质量测定及详细结构解析的能力，可对复杂生物样品进行系统表征。鉴于GlycoRNA丰度低且结构复杂，先进的基于质谱的糖组学策略不仅有助于GlycoRNA的定性与定量分析，还可在复杂生物基质中区分结构异构体。

此文综述了近年来基于质谱的糖组学方法进展，包括样品采集、RNA提取、GlycoRNA富集、糖链释放与纯化、可选衍生化、液相色谱（LC）分离、质谱检测以及数据分析流程，为GlycoRNA的可靠鉴定与结构解析提供系统化的工作流程参考（Fig. 1）。

起始样本的制备直接决定后续质谱鉴定的准确性与可重复性。对于 GlycoRNA 而言，技术难点并不只在于低丰度，更在于其糖链信号极易受到糖蛋白、黏蛋白等高丰度糖基化分子的干扰。因此，在方法学设计上需要同时兼顾 RNA 完整性保护与非 RNA 来源糖链的严格去除。常规的有机相提取法（如 TRIzol 及其改良试剂）仍是获得总 RNA 的基础手段，其优势在于高回收率和对 RNA 结构的良好保存；随后结合小 RNA 选择性柱纯化，可富集 17–200 nt 范围内的短链 RNA 群体，从而在一定程度上降低长链 RNA 和核糖体 RNA 的背景信号。

在获得相对纯净的RNA群体之后，GlycoRNA 的特异性富集成为关键环节。目前常用的标记与富集策略大致可归纳为四种类型，其核心差异在于标记发生的时间点以及对天然糖链结构的影响。第一类为代谢化学报告（metabolic labeling），即在细胞培养阶段引入可被糖代谢通路利用的叠氮或炔基修饰单糖前体，例如四乙酰化叠氮糖衍生物（Ac4ManNAz、Ac4GlcNAz、Ac4GalNAz等），使其在细胞内被掺入新合成的糖链中，随后通过点击化学实现生物素化或荧光标记并进行亲和捕获。这类方法适用于细胞系模型，能够实现体内标记，但不适用于临床组织样本。第二类为基于邻位二醇氧化的化学标记策略（rPAL），利用唾液酸残基中典型的邻位二醇结构，经高碘酸选择性氧化生成醛基，再与氨氧基或肼基标签偶联，实现对唾液酸化GlycoRNA的化学捕获。这一方法不依赖细胞代谢过程，更适合组织或体液样本。第三类为酶学转移标记，即借助唾液酸转移酶（StCEL）将带有可检测基团的修饰唾液酸转移到天然糖链末端，通过酶的底物特异性提高标记的选择性与效率。第四类为凝集素（lectin）亲和富集，利用凝集素对特定糖基基序（如岩藻糖化或高甘露糖型结构）的识别能力实现选择性捕获。需要指出的是，凝集素识别依赖糖链空间构型，存在一定的偏好性，因此通常与化学或酶学标记方法联合使用，以提高结果的可靠性。

在细胞外囊泡（EV）相关研究中，还需额外考虑 GlycoRNA 的拓扑定位问题。部分研究提示 GlycoRNA 可能位于囊泡腔内，而另一些则观察到其暴露于囊泡表面，因此在 EV 分离后应结合膜完整性检测、蛋白酶或糖苷酶可及性实验以及后续质谱分析，以区分表面结合与内含 RNA 的不同来源。只有在明确样本来源与拓扑结构的前提下，GlycoRNA 的谱学数据才能被准确解释并用于后续功能研究。

从 RNA 上释放完整且结构信息保留的糖链，是实现高置信结构解析的必要步骤。当前研究通常采用在糖蛋白分析中广泛使用的内切糖苷酶（如 PNGase F 和 Endo F2/F3）来从 RNA 上释放 N-聚糖。在温和条件下，PNGase F 可切断天冬酰胺侧链与最内侧 GlcNAc 残基之间的糖苷键。相比之下，Endo F2 和 Endo F3 则水解 N-聚糖核心区两个最内侧 GlcNAc 单元之间的 β-1,4-糖苷键，使单个 GlcNAc 残基保留在蛋白质或肽底物上，质谱检测到特征性的 acp³U-GlcNAc 碎片离子，从而证实 acp³U 是 N-糖基化的连接位点。与之相比，O-连接糖链的核心结构多样，酶学工具覆盖有限，因此化学方法被广泛用于释放 O-连接型糖链。在经典的 β-消除方法中，O-连接型糖链在碱性条件下（通常使用氢氧化钠）释放，同时加入还原剂（如硼氢化钠）以稳定释放的糖链并抑制碱诱导的“剥落反应”。这种采用酶学与化学方法的组合，最大限度保留唾液酸等不稳定基团的构型信息，从而提升下游 MS 的结构解析能力和定量准确性。

鉴于 GlycoRNA 在生物样本中的低丰度，释放后对糖链的高效纯化是提高信噪比与异构体分辨率的关键。多孔石墨化碳（PGC）因其能够通过糖链与石墨化碳表面之间的多重相互作用在糖链异构体分离上表现尤为出色，而亲水相互作用色谱（HILIC）则更适合处理带衍生标签或荧光标记的糖链并兼顾通量需求。为提高对截短型或小尺寸糖链的捕获率，研究者发展了诸如 PGC–硼酸杂化等改良固相材料；同时，经济型的 HILIC-SPE 基质也在微量血清样本中展示出可行性。在同时关注N糖与O糖的研究中，通常通过串联或并联使用不同的富集材料与色谱模式，以尽可能覆盖糖型多样性并兼顾样本通量。

天然糖链通常电离效率较低，且含有不稳定基团，可能影响分析灵敏度和准确性。为克服这些问题，常采用衍生化策略以提高化学稳定性、增强电离效率并提升定量精度。

全甲基化方法通过将糖链中的羟基与羧基甲基化，提高分子疏水性与稳定性，从而显著增强正离子模式下的电离效率，并改善在反相液相色谱中的保留行为。这一策略尤其适用于低丰度样本的高灵敏检测，同时有助于稳定唾液酸残基，减少其在电离与碎裂过程中的损失。由于全甲基化会统一修饰多数可反应位点，其优势在于整体信号增强与谱图简化，但对某些微小结构差异的区分能力依赖于后续碎裂模式的配合。

还原胺化试剂法则通过与糖链还原端的醛基发生缩合反应，引入带有荧光或增强电离基团的标签，例如 2-AB 或 RapiFluor-MS。该策略在提高 MS 响应的同时，兼具荧光检测能力，适合与 HILIC 分离联用，实现较为稳定的定量分析与高通量检测。相比全甲基化，还原胺化更侧重于末端标记与信号放大，在保持主体糖链结构框架的同时提升检测一致性。

液相色谱（LC）通常与 MS 联用，根据糖链的理化性质进行分离，从而提高异构体分辨能力并增强分析灵敏度，构成了糖组学的主力技术路径。常用于糖链分析的色谱技术包括反相液相色谱（RPLC）、亲水相互作用液相色谱（HILIC）和多孔石墨化碳色谱（PGC）。对于衍生化产物，RPLC提供了优良的保留与分离性能；HILIC更适合极性糖链的分离；而 PGC 在未衍生化糖链的异构体分辨上具有显著优势。

在LC分离之后，洗脱组分进入质谱进行不同模式的数据采集。糖组学中三种主要的数据采集策略包括数据依赖采集（DDA）、数据非依赖采集（DIA）和并行反应监测（PRM）。传统的DDA便于对高丰度目标进行详细结构解析，但在低丰度GlycoRNA的系统鉴定中可能表现出采样偏差；DIA通过覆盖质量范围内的所有前体窗口提供了更为全面且无偏的数据，有利于低丰度物种的识别与定量；PRM则适用于靶向验证阶段的高灵敏定量。

基于质谱的糖组学分析通常会产生规模庞大且结构高度复杂的数据集，其根源在于糖链的非模板合成机制所带来的显著结构异质性。因此，系统化的生物信息学工具成为数据解析过程中不可或缺的核心支撑。近年来，多种面向不同分析层面的软件平台被开发，用于糖链结构注释与功能挖掘（表1）。

早期代表性工具如 GlycoWorkbench，可根据用户设定的候选结构计算理论碎片质量，并与实验谱图匹配以实现结构赋值，在人工辅助注释方面具有实用性，但主要适用于 MALDI 数据，且在大规模数据处理中的扩展性有限。随着数据复杂度提升，深度学习方法逐渐被引入糖链解析。基于Transformer架构的 GlycoBERT 和 GlycoBART 能够直接从 MS/MS 数据中预测糖链结构并支持 de novo 测序，突破了传统数据库依赖的部分限制。与之类似，GlycoNote 通过依据单糖组成与修饰类型动态生成任务特异数据库，实现串联质谱数据的自动化糖链组成分析，提升了跨样本适应性。

在结构鉴定之外，分析重点也逐渐转向功能层面的解释。Glycan Finder 结合肽段与糖基搜索策略，既可进行数据库驱动的完整糖肽鉴定，也支持未收录糖链的 de novo 解析，从而应对复杂碎裂谱带来的结构判读难题。GlyTrait 则通过计算 N-聚糖数据中的衍生特征参数，自动提取具有生物学意义的功能属性，使分析视角由单纯丰度统计拓展至功能型糖链谱特征评估。

需要指出的是，上述多数工具主要基于 DDA 数据构建。为提升低丰度糖链的覆盖度与定量准确性，基于 DIA 采集模式的 GlycanDIA Finder 工作流程被建立，并配合专用搜索引擎实现更高灵敏度与准确度的糖链鉴定与定量，为复杂样本的系统性分析提供了重要补充。

将谱图转化为高置信结构注释与生物学结论，需要自动化工具、谱库与机器学习方法的共同支持。传统基于理论碎片匹配与数据库搜索的方法适用于已知糖型的解析，但面临未知或新型糖链时的局限。近年来，基于深度学习的 de novo 预测工具与面向 DIA 的定量引擎显著提高了对低丰度组分的识别能力。与此同时，功能层面的分析需要从单纯的丰度统计向糖基序与组织/病理特征的关联挖掘转变，为此亟需建设包含 RNA-glycan 特有碎片模式、连接位点候选与样本来源注释的专用数据库。社区共建的谱图库与标准化的数据格式将有助于提升不同实验室间的数据可比性，并加速候选生物标志物的验证进程。

表 1 基于质谱的糖链鉴定相关计算软件汇总

成熟的质谱方法学为 GlycoRNA 的系统性谱系描绘提供了技术基础，使研究者能够在不同生理与病理背景下比较糖链组成与丰度分布的差异。通过精细分离与高分辨检测，不同来源样本中的 RNA 相关糖链模式得以与蛋白来源糖链进行直接对照，从而揭示其独特性。

Flynn 等采用 PGC-LC-MS/MS 从 HEK293T、H9 和 HeLa 细胞的小 RNA 群体中释放糖链，并与同源细胞蛋白来源的糖链进行比较分析。结果显示，HEK293T 和 H9 细胞中的 RNA 更倾向于携带岩藻糖化结构，而 HeLa 细胞的 GlycoRNA 则以唾液酸化糖链为主要特征。这一差异提示，RNA 相关糖链并非蛋白糖链的简单“镜像”，而是具有细胞类型依赖的独立谱系特征。

基于 GlycanDIA 工作流程的分析结果同样支持 RNA 与蛋白样本在糖链谱上的显著差异（见图3）。在对5种小鼠组织的系统比较中，RNA 样本中鉴定出超过 200 种不同的 N-糖链，并呈现明确的组织特异性分布模式。例如，在脑组织中，岩藻糖化结构约占总糖链的 75%，为优势类型；而在心脏组织中，则以高甘露糖型糖链为主导。这种组织依赖性的分布格局，进一步说明 GlycoRNA 可能参与特定组织的功能调控。

在人类样本层面，正常与肿瘤组织的比较显示，唾液酸化 GlycoRNA 在肿瘤样本中呈现显著上调趋势。与此同时，Tian 等利用 RPLC-MS/MS 对 12 种健康人类器官进行系统表征，发现多数器官中 N-连接岩藻糖化糖链占据较高比例，且在脑组织中尤为丰富。上述研究共同表明，GlycoRNA 的糖链谱不仅具有稳定的组织特异性特征，也在疾病状态下发生可检测的重塑。

总体来看，不同组织中的 GlycoRNA 呈现出独特且可重复的糖链组成与丰度模式，尤其是岩藻糖化与唾液酸化结构的差异性表达，可能为疾病诊断与预后评估提供候选分子标志。这些发现进一步凸显了基于质谱的 GlycoRNA 糖链谱分析在连接 RNA 糖基化与健康、疾病分子机制之间所具有的重要研究价值。

GlycoRNA 作为糖生物学与 RNA 生物学交叉的新兴方向，已在多种哺乳动物细胞与物种中得到验证，显示出良好的保守性与广泛性，并被认为参与细胞稳态、免疫调控及环境响应等过程。然而，从“存在性证据”迈向“机制解析”，仍依赖方法学与技术体系的持续突破。

随着研究从单一糖链鉴定走向系统性解析，质谱策略正由单维检测向多维整合发展，不仅需要解析 N-糖与 O-糖的组成差异及动态变化，还需关注糖基化与其它RNA修饰（如m6A）之间的协同关系。围绕这一需求，云序生物构建了覆盖 N-糖、O-糖及多修饰共解析的质谱分析体系，实现糖链结构、丰度及修饰网络的系统表征，为 GlycoRNA 的机制研究提供更完整的分子图谱。