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真核生物mRNA上存在着十余种不同类型的化学修饰。这些修饰由写入蛋白（writer）负责催化沉积，在某些情况下可由擦除蛋白（eraser）去除，而其调控作用主要通过阅读蛋白（reader）实现——这些蛋白解读修饰信息，进而调控下游的分子功能与细胞表型。在大多数情况下，RNA修饰的调控功能均由这些结合蛋白执行，其机制既包括对修饰核苷酸进行直接识别，也包括感知修饰诱导的RNA结构变化。这些结合蛋白如何解读单个修饰，是理解调控机制的核心，然而目前仍有众多下游“读取”通路尚未被完全阐明，其中往往涉及多种RNA结合蛋白，并在RNA生命周期的多个层面形成调控网络。本节首先以细胞模型研究为基础，概述m6A（作为含量最丰富、研究最深入的内源mRNA修饰）已知的效应蛋白及其作用机制；随后探讨其在人类疾病（体内）中的功能影响；最后将该框架拓展至其他内源mRNA修饰，系统阐述这些修饰的分布丰度、已知效应因子及其功能。

图1.m6A及其他内部mRNA修饰的转录后调控和效应因子

表2. RNA修饰、测序方法、效应蛋白和分子功能

m6A是真核生物mRNA中含量最丰富、特征最鲜明的内部修饰。在哺乳动物中，每条转录本通常平均含有2–3个m6A位点，主要位于保守基序DRm6ACH（R=G/A/U,H=A/C/U）中。m6A虽可分布于整个转录本，但其在拓扑结构上显著富集于终止密码子及3′UTR附近。绝大多数mRNA上的m6A由专门的“writer”复合物负责沉积，该复合物以METTL3-METTL14（甲基转移酶样蛋白3和14）异源二聚体为核心，并与之结合的多个辅助组分协同调控其活性与特异性（图1A）。与内部m6A不同，N6,2′-O-二甲基腺苷（m6Am）紧邻m7G帽结构，由PCIF1催化形成，存在于约四分之一的哺乳动物mRNA上。重要的是，m6A具有可逆性：特定位置的m6A可被去甲基化酶FTO和AlkB同源蛋白5（ALKBH5）主动去除（图1A）。内部mRNA上的m6A可被“reader”识别，进而指导甲基化转录本的代谢与命运（图1A）。迄今为止，研究最广泛的读取器是含YTH结构域的蛋白家族：YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、YTHDC1、和YTHDC2，而已被鉴定的m6A结合蛋白仍在不断增多。

对m6A表观转录组的表征，已从早期基于抗体的方法（MeRIP-Seq），发展到酶促或化学转化辅助的二代测序技术（GLORI），以及直接长读长测序（表1）。这些技术上的进步，如今已能实现低起始量样本和单细胞水平的m6A图谱分析，从而能够更精确地检测m6A在生物学和生理学过程中的动态变化。

尽管许多m6A位点以顺式方式“固有编码”，并在不同细胞类型和物种间保守，但研究揭示出显著的细胞间异质性及背景特异性的动态变化，尤其是在细胞状态转变和对外界刺激响应的过程中，凸显出复杂且多层次的调控格局。

METTL3-METTL14甲基转移酶复合物在mRNA上催化m6A沉积于保守的DRACH基序内；然而，这些基序中仅有很小一部分（约5%）实际被甲基化。此外，m6A的分布呈现出独特的拓扑偏好性：富集于长的外显子及终止密码子附近。已有研究表明，特定的转录因子、RNA结合蛋白、组蛋白修饰（如H3K36me3）以及RNA聚合酶II可引导甲基转移酶复合物到达其靶向位点，从而在相应的转录本及染色质相关非编码RNA上实现选择性的m6A沉积。然而，仅凭这些主动招募通路，尚无法完全解释在转录组中观察到的全局性且高度保守的m6A拓扑分布特征。

近期“m6A抑制因子”的发现重塑了我们对沉积特异性的认识。外显子连接复合物（EJC）及其相关蛋白已被证实可通过近端RNA包装，在空间上阻碍甲基转移酶复合物接触众多DRACH序列，从而抑制m6A沉积。对新生RNA与稳态RNA中m6A丰度的比较分析显示，相当一部分m6A修饰（约三分之二）是在转录后沉积的，尤其是在高度甲基化的转录本中。这支持了如下模型：在大部分m6A沉积之前，EJC已结合于外显子连接处，并通过其相关蛋白将邻近的RNA区段进行包裹，从而保护这些区域免受修饰。这一机制也解释了为何某些非编码RNA（如LINE1）具有高水平的m6A——这些RNA通常不经历剪接，因此可规避EJC介导的抑制。EJC介导的m6A抑制机制为m6A在长的内部外显子（EJC结合位点相距较远）及终止密码子附近（因最后一个外显子通常较长）的富集提供了机制基础。甲基转移酶复合物也可被转录因子招募，以实现对特定调控子（regulon）的调控，例如DNA损伤反应中的p53或免疫激活过程中的核因子κB（NF-κB）。此外，新生RNA上的共转录m6A沉积对于调控局部转录具有重要意义。综上所述，这些多样化的调控模式，为大多数生物过程中通过RNA m6A实现的调控提供了复杂的层次结构。

m6A的调控主要取决于其结合蛋白。迄今为止，研究最为深入的一类m6A结合蛋白是YTH结构域家族：YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、YTHDC1和YTHDC2。尽管YTHDF蛋白共享一个高度保守的C端m6A结合YTH结构域，这曾导致人们将其功能简单归结为冗余，但它们实际上拥有不同的N端序列，其中包含多个内在无序区（IDR）。这些IDR经历不同的翻译后修饰，并促进形成不同的相分离凝聚体。这种结构上的差异，决定了它们在特定生物学过程中的独特功能，而在其他细胞环境下，这些蛋白又表现出功能冗余且具有补偿性的活性。

在三个YTHDF旁系同源蛋白中，YTHDF2是介导mRNA降解的原型（图1A），而YTHDF1则能在特定细胞情境下促进翻译（图1A）。与这些功能一致，YTHDF2富集于加工小体（P-body）中，该结构负责调控mRNA的命运；而YTHDF1和YTHDF3则优先定位于应激颗粒（SG）（图1A）。所有三种蛋白均对P-body的结构完整性有贡献，同时缺失三者会导致P-body组装缺陷，并以不依赖于m6A的方式引起全局mRNA稳定性增加。值得注意的是，YTHDF2可通过表皮生长因子受体（EGFR）信号通路经胞外信号调节激酶ERK1/ERK2介导的磷酸化（S39/T381）而被稳定，同时YTHDF2还能在K571位点发生SUMO化修饰，而该残基在YTHDF1/3中并不存在（图1A）。

YTHDF2的N端将结合的mRNA分配至降解复合物中，以促进其降解。相反，YTHDF1凭借其独特的N端结构域，可与核糖体或其伙伴蛋白脆性X智力迟钝蛋白（FMRP）共凝聚，从而在刺激条件下增强神经元中的翻译（图1A）。YTHDF1还能以不依赖m6A的方式，与溶酶体及mTORC1相互作用，调控胆固醇的生物合成。单分子标记研究表明，各YTHDF蛋白结合的靶标具有独特性，但在其他情境下，它们又能发生物理相互作用，共同调控许多共享的转录本。此外，通过m6A/YTHDF2降解轴实现的EJC保护与mRNA稳定性之间的偶联，在人类、小鼠和斑马鱼中均存在，但在果蝇或线虫中未观察到。果蝇缺乏YTHDF2的同源物，仅有一个促进翻译的YTHDF1同源蛋白。由此可见，m6A/YTHDF2降解轴显然是随着外显子结构的演化而出现，并在脊椎动物中调控mRNA的稳定性。

除YTH家族外，其他RNA结合蛋白也能通过替代机制识别m6A。胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白（IGF2BP1-3）利用K同源（KH）结构域识别m6A，而富含脯氨酸的卷曲螺旋蛋白2（PRRC2A、PRRC2B和PRRC2C）则通过富含甘氨酸、精氨酸和谷氨酸的结构域结合m6A。与YTHDF2促进降解的功能相反，IGF2BP主要稳定其靶标，但也能够以情境依赖的方式调控翻译，通常是通过将转录本差异分配至多聚核糖体和P-body之间来实现（图1A）。m6A结合蛋白的谱系仍在不断扩展，未来需要进一步研究以明确它们特定的调控作用及其分子机制。

m6A并非一种被动的修饰，其甲基基团可以被去甲基化酶催化去除。目前已鉴定FTO和ALKBH5作为m6A去甲基化酶，两者均属于人类AlkB家族。尽管它们共享一个高度保守的催化核心结构域，但其非催化结构域却存在显著差异。FTO具有一个独特的C端结构域，其折叠方式独特，可能介导额外的蛋白质或RNA相互作用。相比之下，ALKBH5则带有一个较长的C端低复杂度区域（LCR）。该C端LCR对于ALKBH5形成凝聚体（例如与外显子连接复合物EJC共凝聚）至关重要，并使其去甲基化活性限制于特定的甲基化转录本。这些结构上的差异很可能决定了它们不同的底物偏好和生物学功能。

在机制上，FTO和ALKBH5也采用不同的氧化去甲基化途径：FTO催化生成N6-羟甲基腺苷作为半稳定的中间产物，导致腺苷和甲醛的释放速度较慢；而ALKBH5则利用一种独特的共价机制快速生成终产物。这些机制差异的功能意义仍有待详细阐明。

迄今为止，针对ALKBH5的研究主要集中于mRNA m6A的去甲基化，而FTO则展现出更广泛的、具有背景相关性的底物谱。FTO可作用于mRNA和carRNA内部的m6A、mRNA帽结构上的m6Am，以及特定tRNA上的m1A，其具体作用取决于不同生物学环境下的细胞定位。体外与体内的活性存在关键差异：尽管在体外，FTO对帽结构m6Am的催化活性高于对内部m6A的活性，但在细胞内，它主要对内部m6A进行去甲基化，这主要是因为细胞内部mRNA m6A的水平比帽结构m6Am高出10到30倍。

针对发育系统、多种组织（尤其是脂肪组织和神经元）以及人类类器官的研究均一致表明，m6A是FTO的主要生理底物。从遗传学角度来看，由FTO失调引起的发育缺陷和细胞表型，与m6A writer和结合蛋白扰动所产生的表型高度相似，但与帽结构m6Am writer PCIF1缺失相关的表型则不同。在癌症中，FTO对特定癌基因或抑癌基因内部mRNA m6A进行去甲基化，从而调节其稳定性或翻译效率，进而影响肿瘤的发生、进展和治疗反应。相比之下，缺乏帽结构m6Am的小鼠模型仅表现出中等程度的表型，这提示未来需要进一步研究以阐明FTO介导的帽结构m6Am去甲基化的生理相关性。

最后，这些通路的功能保守性延伸至植物界。植物缺乏mRNA帽结构m6Am，但其mRNA和染色质相关RNA（carRNA）中富含内部m6A。在作物（如水稻和马铃薯）中异源表达哺乳动物的FTO，可驱动植株生长，表现为产量、生物量和抗逆性提高。从机制上看，这些效应与染色质调控和重复RNA的m6A去甲基化相关，而非与mRNA帽结构m6Am的去甲基化相关。

m6A作为一种关键的调控机制，协调着转录后mRNA的加工与代谢。在细胞状态维持、谱系转变以及刺激响应过程中，m6A能够实现转录组的快速重编程，从而驱动细胞类型特异性的功能输出（图2A）。

值得注意的是，m6A介导的转录后调控具有高度的环境依赖性，通过操纵writer和eraser酶会产生互补（或相反）的表型。这种效应在干细胞多能性、代谢性疾病、神经元功能、以及急性髓系白血病（AML）中尤为显著。在此，文章整合了近期关于m6A在发育、干细胞维持与重编程、免疫、以及肿瘤微环境（TME）中调控作用的体内研究进展。

图2. mRNA m6A在调节TME内细胞自我更新与分化及免疫反应中的作用

Mettl3或Fto的缺失会导致小鼠胚胎致死，这一发现凸显了m6A在发育过程中的核心作用。在胚胎干细胞（ES）命运转变过程中，METTL3介导的m6A沉积促进了编码多能因子及细胞类型特异性关键转录因子的基因更新。FTO通过去除染色质相关调控RNA（carRNA）（尤其是重复RNA）上的m6A来调控发育，而ALKBH5则通过mRNA m6A去甲基化调节人内胚层分化及小鼠生育能力。综合来看，这些研究确立了一个范式：m6A通过标记关键发育调控因子的转录本，促进其更新，从而使得细胞命运转变所必需的转录组重编程得以顺利进行。

由m6A writer和eraser所决定的甲基化谱，最终通过特定的m6A结合蛋白驱动生物学结果。尽管其中许多修饰识别通路仍有待完全阐明，且可能涉及多种环境特异性的m6A结合蛋白，但其功能需求在不同物种中都是显而易见的。例如，m6A介导的RNA降解对斑马鱼的发育至关重要，Ythdf2缺失会导致母源转录本清除受损，并延迟母源-合子转换。在小鼠中，Mettl3缺失通过破坏YTHDF2介导的“内皮身份基因”降解，从而损害内皮-造血细胞转化。值得注意的是，小鼠中Ythdf2的敲除会导致晚期胚胎致死及发育缺陷，主要原因是转录组更新受阻。相比之下，Ythdf1敲除小鼠能够存活，且无明显发育缺陷；然而，它们表现出长期学习与记忆能力缺陷，以及树突状细胞（DC）活化受损，这些过程均依赖于YTHDF1的翻译促进功能。

m6A对干细胞命运决定也具有显著影响。METTL3和METTL14在造血干细胞和祖细胞（HSPC）中高表达，但在髓系分化过程中表达下调。两者在急性髓系白血病（AML）中同样存在过表达。在AML中，敲低这两种蛋白会损害细胞生长，这很可能是由于改变了细胞（负责维持自我更新并阻断分化）状态特异性转录本上的m6A修饰所致。去甲基化酶ALKBH5和FTO对于AML的进展以及白血病干细胞/起始细胞（LSC/LIC）的自我更新也至关重要，其主要通过癌基因转录本或免疫检查点转录本的m6A去甲基化发挥作用，提示靶向m6A甲基转移酶和去甲基化酶在AML治疗中具有潜力。

在下游，YTHDF2通过促进其m6A结合靶标（包括许多维持HSC状态的转录因子）的降解，充当平衡造血干细胞（HSC）自我更新与分化的分子开关。抑制YTHDF2可以阻断HSC分化并增强HSC自我更新，从而实现从人脐带血（hUCB）等来源中高效离体扩增功能性HSC并用于移植。同时，YTHDF2的缺失还能通过稳定肿瘤坏死因子受体转录本，选择性清除LSC。因此，使用小分子抑制剂或小干扰RNA（siRNA）靶向YTHDF2，为扩增HSPC提供了一种前景广阔的策略，且不会增加致白血病风险或导致谱系分化偏倚。除YTHDF2外，IGF2BP也通过识别和稳定m6A甲基化转录本，在AML中发挥重要作用。

由于YTHDF2-m6A轴介导转录组转换以平衡干细胞自我更新与分化，因此靶向YTHDF2依赖的转录本更新可能增强干性，为其他细胞类型的干细胞治疗及免疫细胞工程化改造提供新的策略。

除了在细胞状态转变过程中协调甲基化转录本的更新外，m6A还能促进响应外界刺激时的转录组快速重编程，这一特性在免疫调控中尤为显著。具体而言，m6A在肿瘤微环境（TME）内调控免疫细胞的分化、成熟及抗肿瘤免疫应答。

近期研究强调了m6A writer通过甲基化和调控关键转录本的更新来塑造TME内免疫细胞功能的关键作用。METTL3对于维持T细胞稳态和分化、促进滤泡辅助性T细胞发育以及维持调节性T细胞（Treg）的抑制功能至关重要。它还能维持自然杀伤（NK）细胞稳态，调控TME中NK细胞的浸润与效应功能。METTL3可发生乳酸化修饰，从而促进肿瘤浸润髓系细胞的免疫抑制功能。METTL3和METTL14通过重塑TME（与巨噬细胞重编程或肿瘤浸润细胞相关联），控制对anti-PD-1疗法的反应。在肿瘤相关巨噬细胞（TAM）中，METTL14的缺失会导致CD8+T细胞功能障碍及肿瘤进展。总体而言，这些研究凸显了m6A作为癌症中大多数免疫细胞谱系的一个基本调控层面，尽管其作用具有高度的环境依赖性。

去甲基化酶也通过靶向特定mRNA转录本，在免疫调控中发挥关键作用。FTO通过糖酵解调控促进肿瘤免疫逃逸，而敲低FTO可削弱肿瘤细胞糖酵解、恢复CD8+ T细胞功能并抑制肿瘤生长。在肝细胞癌中，抑制FTO可增强肿瘤浸润CD8+ T细胞的活化与募集，使肿瘤对anti-PD-1治疗更加敏感。在AML中，FTO有助于重金属ATP酶（HMA）介导的免疫检查点基因上调。在黑色素瘤中，抑制FTO还能增强细胞对干扰素γ的敏感性，提高anti-PD-1治疗的效果，而维生素E琥珀酸酯则可降解FTO，抑制肿瘤生长并克服免疫治疗耐药。与FTO类似，ALKBH5通过调节CD4+ T细胞的致病性来促进自身免疫，并通过调控TME中的乳酸水平及抑制性免疫细胞积累，影响抗PD-1疗法的效果。综上所述，这些发现表明，这些去甲基化酶的抑制剂可能与癌症免疫疗法产生有效的协同作用。

与“m6A结合蛋白决定了由writer和eraser设定的m6A生物学结果”观点相一致，YTHDF蛋白在功能上似乎与肿瘤微环境（TME）中的免疫抑制密切相关，其作用机制是通过调控大多数细胞类型（包括肿瘤相关巨噬细胞（TAM）、树突状细胞（DC）、B细胞、自然杀伤（NK）细胞、调节性T细胞（Treg）和髓源性抑制细胞（MDSC））中关键m6A修饰转录本的稳定性与翻译来实现（图2B）。因此，它们代表了一些最有希望的免疫调节靶点。

值得注意的是，YTHDF2通过增强CD8+ T细胞反应来协调TAM的重编程及抗肿瘤免疫，其在TAM中的缺失会促进抗肿瘤表型的形成并改善抗原交叉提呈，从而抑制肿瘤生长。类似地，放疗（RTx）后YTHDF2表达升高与免疫抑制性MDSC的诱导有关，而髓系细胞特异性缺失YTHDF2则通过改变MDSC的分化和浸润来增强抗肿瘤免疫并克服放疗抵抗。在Treg细胞中，YTHDF2的缺失会增加Treg凋亡并削弱其在TME中的抑制功能，从而减少肿瘤生长。在这些案例中，保守的YTHDF2-m6A-NF-κB轴均有所涉及，m6A影响NF-κB通路，而YTHDF2本身的转录又被NF-κB上调。YTHDF2-m6A介导的降解途径对于NK细胞的稳态和最终成熟也至关重要，YTHDF2缺乏会削弱NK细胞的抗肿瘤和抗病毒免疫。YTHDF2和YTHDF1分别通过关键靶标的转录本不稳定和翻译激活来调节DC中的抗肿瘤免疫。临床上，肿瘤及癌旁组织中YTHDF1的水平与CD8+ T细胞浸润及免疫检查点抑制剂（ICI）疗效呈负相关，凸显了其在人类癌症中的免疫抑制功能。

综合来看，这些发现表明YTHDF-mRNA m6A轴在TME的免疫抑制途径以及细胞转变过程中的转移级联中发挥着关键和多方面的作用，使肿瘤细胞能够在复杂的TME中生存。靶向YTHDF2、YTHDF1或两者同时靶向，对于在免疫疗法、放疗、核疗法、化疗以及依赖宿主免疫清除肿瘤的相关疗法中增强免疫反应具有巨大潜力。未来需要对m6A-YTHDF-TME轴进行更全面的理解，特别是在与人类疾病高度相关的模型中。此外，后续研究还应探索m6A在其他免疫相关疾病（如自身免疫病或慢性炎症，包括纤维化和神经退行性疾病）中的作用，以明确YTHDF-m6A通路是否也发挥抑制性作用，以及该抑制通路的缺陷是否会关联疾病进展。

同样重要的是，m6A甲基化通过影响葡萄糖和脂质代谢，对代谢稳态发挥关键调控作用。在β细胞中，受氧化还原调控的METTL3通过甲基化关键介质转录本，进而调控1型糖尿病中的先天免疫反应。METTL3对于棕色脂肪组织的出生后发育及能量消耗至关重要。该甲基转移酶复合物已被证实可在生理及2型糖尿病状态下调节人β细胞生物学功能，并通过不依赖于UCP1的前列腺素信号轴影响棕色脂肪中的全身胰岛素敏感性。在肝脏中，ALKBH5通过GCGR和mTORC1信号通路的m6A依赖性及非依赖性途径，调节葡萄糖和脂质稳态。相比之下，FTO作为首个通过全基因组关联研究（GWAS）鉴定的肥胖相关基因，与脂肪生成和代谢紊乱密切相关，但其在体内的确切底物及作用机制仍在深入研究中。综上所述，这些研究将代谢调控定位为m6A生物学中一个快速发展的前沿领域。

在神经元中，胚胎小鼠大脑中Mettl14或Mettl3的缺失会延长放射状胶质细胞的细胞周期，并将皮层神经发生延伸至出生后阶段。胚胎期下丘脑中Mettl14的缺失会导致成年后肥胖、葡萄糖-胰岛素稳态受损及能量摄入增加，其主要原因是下丘脑弓状核中摄食相关神经元的减少。缺失Mettl3或核内m6A reader Ythdc1也观察到了相似的表型，这与FTO过表达时出现的肥胖表型一致，为FTO通过m6A通路发挥作用提供了遗传学证据。值得注意的是，YTHDF蛋白差异性调控带有m6A标记的神经元mRNA的亚细胞定位。YTHDF2介导mRNA降解，从而抑制TGF-β信号通路并维持出生后海马神经干细胞处于静止状态；而突触活动则会招募YTHDF1，激活可塑性相关基因的局部翻译，进而影响海马依赖的学习与记忆。YTHDF蛋白这些不同的神经元功能，很可能是由差异性的O-GlcNAc糖基化修饰，或神经元刺激后YTHDF1与磷酸化FMRP特异性共凝聚所导致。

m6A在癌症进展中的功能意义已得到充分证实，并在其他文献中得到了全面综述（回顾链接：RNA修饰跃升癌症核心前沿！《Cancer Cell》重磅综述绘制最全功能-机制-治疗图谱）。RNA甲基化异常最初在急性髓系白血病（AML）中得到广泛研究，并证实METTL3、FTO和ALKBH5在其中发挥致癌或环境依赖性的作用；如今，这种异常已被认为是多种实体瘤中普遍存在的特征。

机制性研究已描绘出相关通路及治疗协同作用，揭示了m6A效应因子如何调节对标准和免疫治疗的敏感性。例如，抑制YTHDF2可破坏髓源性抑制细胞（MDSC）中的IR-YTHDF2-NF-κB正反馈回路，从而增强放疗/免疫疗法联合治疗的疗效。在mTORC驱动的癌症中，mTORC1激活writer复合物，增强靶标转录本的甲基化与降解，从而刺激癌症生长。在AML中，R-2-羟戊二酸（R-2HG）通过靶向FTO/m6A/MYC/CEBPA信号通路发挥抗肿瘤作用，并且抑制FTO与HMA/PD-L1抑制剂联用具有协同效应。酪氨酸激酶抑制剂（TKI）可诱导FTO上调和m6A去甲基化，进而导致TKI耐药。m6A通路参与这些关键信号通路及致癌通路，进一步提示其作为未来联合疗法靶点的潜力。

在靶向m6A效应因子（尤其是METTL3和FTO）的小分子抑制剂开发方面已取得重要进展。值得注意的是，尽管这些药物均尚未进入标准治疗方案，但其中数种在实体瘤中展现出良好的转化前景，在临床前模型中具有强效的疗效，且有多个候选药物已进入临床试验阶段。鉴于m6A修饰因子常参与化疗和免疫治疗耐药性的形成，其最直接的临床价值很可能体现在合理的联合治疗方案中。未来的工作应致力于通过识别实体瘤中环境特异性的脆弱点，并开发具有足够治疗效果的抑制剂，来缩小临床前验证与临床应用之间的差距。

除m6A之外，丰度较低的内源mRNA修饰，如假尿苷（Ψ）、2′-O-甲基化（2′-O-Me或Nm）、5-甲基胞苷（m5C）、N7-甲基鸟苷（m7G）和N1-甲基腺苷（m1A），同样作为RNA生物学的关键调控因子发挥功能。本节将概述它们的化学计量、调控机制及功能重要性。

3.1.1.Ψ

Ψ是尿苷的异构化形式，常被称为RNA的“第五种核苷酸”，是哺乳动物中含量最丰富的修饰之一，在rRNA和tRNA中密度尤其高。在mRNA中，最初鉴定出数百个Ψ修饰位点，随后在哺乳动物中观察到其水平显著更高。mRNA上的Ψ富集于编码序列（CDS）和3′UTR，但在5′UTR中分布较少。在人细胞系中，大多数mRNA Ψ位点的修饰化学计量比较低；然而，小鼠组织样本中则存在更高比例（通常高于20%）的Ψ位点。

假尿苷合成酶（PUS）催化U异构化为Ψ。这些Ψ writer可分为两个亚类：独立型PUS酶通过直接识别RNA序列和/或结构特征来形成Ψ；而先天性角化不良症蛋白1（DKC1）则作为小核仁RNA（snoRNA）-蛋白复合物（snoRNP）的催化亚基，在H/ACA盒snoRNA的引导下发挥作用，后者通过碱基配对介导对靶标位点的特异性Ψ沉积。TRUB1、DKC1、PUS1和PUS7已被鉴定为负责大多数mRNA Ψ修饰的主要合成酶，其中DKC1也介导rRNA的广泛假尿苷化。

3.1.2.Nm

除碱基修饰外，核糖的2′羟基也可发生甲基化（2′-O-甲基化，Nm）。Nm在rRNA、tRNA和snRNA中丰度很高，并且存在于高等真核生物几乎所有mRNA的5′帽结构中。近期二代测序技术的进展也在mRNA内部位点中发现了Nm。与Ψ类似，Nm的沉积主要通过两种途径实现。在rRNA中，Nm由C/D盒snoRNP共转录添加，该复合物由甲基转移酶FBL、RBP 15.5K、NOP56/NOP58异源二聚体以及通过序列互补性指定修饰位点的C/D盒snoRNA组成。相比之下，tRNA中的大部分Nm由独立型甲基转移酶（如某些Trm蛋白）在转录后添加。对于mRNA，独立型酶在5′帽结构及某些内部位点添加Nm，而C/D盒snoRNP也指导部分内部位点的Nm沉积。

3.1.3.m5C

5-甲基胞嘧啶（5mC）作为一种经典的DNA表观遗传标记，也存在于多种RNA中（在RNA中称为m5C）。虽然m5C在rRNA和tRNA中含量丰富，但在mRNA中相对少见，其化学计量比通常低于10%（相比之下m6A的中位数约为40%），目前已鉴定出数百至数千个位点。RNA上m5C的主要书写器包括NOP2核仁蛋白/Sun RNA甲基转移酶（NSUN）家族蛋白以及DNA（胞嘧啶-5）-甲基转移酶样蛋白2（DNMT2）。m5C可被10-11易位（TET）家族蛋白和ALKBH1进一步氧化为5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）和5-甲酰基胞嘧啶（f5C）。在mRNA中，已鉴定出多种m5C结合蛋白，例如Aly/REF输出因子（ALYREF）、Y盒结合蛋白（YBX1/2）、FMRP、以及富含丝氨酸/精氨酸的剪接因子2（SRSF2）。

3.1.4.m7G

N7-甲基鸟苷（m7G）是一种带正电的修饰，是真核生物mRNA 5′帽结构中必需且普遍存在的组分。m7G也存在于tRNA和rRNA的内部。目前已有报道发现数百个高置信度的mRNA内部m7G位点，富集于编码区和3′UTR，但在5′UTR中较少见。迄今为止，已知唯一的内部m7G书写器是METTL1/WDR4异源二聚体，它可修饰tRNA的第46位以及mRNA上的部分位点。

3.2.1.Ψ

Ψ能够影响RNA的二级结构和终止密码子通读，从而调控翻译、应激反应等多种细胞过程。在tRNA中，位于TΨC环第55、13和39位的Ψ能够稳定tRNA结构、确保翻译准确性，并影响tRNA衍生的小RNA（tsRNA/tRF）的产生。富含于干细胞中的合成酶PUS7指导特定tRNA上的Ψ修饰，生成特定的tRF（称为mTOG），从而抑制干细胞中的翻译。PUS7或mTOG的缺失会损害胚胎发育和造血分化。在敲除PUS7时诱导产生的tRF还能抑制异常蛋白质合成，促进HSPC的植入与分化，并可预测骨髓增生异常综合征的白血病进展。PUS7在胶质母细胞瘤中也存在过表达，对肿瘤发生至关重要，并与不良预后相关。在此情境下，PUS7介导的tRNA假尿苷化使得胶质母细胞瘤干细胞能够实现密码子特异性的翻译调控。

这些发现凸显了PUS7在细胞干性和癌症中的重要功能。然而，近期一项研究还报道了PUS7通过修饰7SKRNA上关键的第250位尿苷（U）来实现转录调控，该位点的假尿苷化限制了正向转录延伸因子b（P-TEFb）复合物的活性，从而全局性抑制转录延伸。这一发现揭示了通过7SK RNA修饰调控细胞命运的潜在可能。

体外转录（IVT）mRNA中的尿苷会激活RNA依赖性蛋白激酶（PKR），导致eIF-2α磷酸化并抑制翻译；而掺入Ψ则可减少PKR激活并增强翻译。在mRNA疫苗中，m1Ψ和Ψ常被用于稳定治疗性IVT mRNA并降低其先天免疫原性，其机制可能涉及削弱内溶酶体加工及Toll样受体（TLR）的结合。然而，它们对翻译保真度和速率的影响及其潜在机制仍有待充分阐明。近期研究表明，mRNA中的m1Ψ和Ψ可能会减慢翻译延伸速度。虽然mRNA中的m1Ψ可增加核糖体密度和保真度，但也可能促进+1核糖体移码，从而导致翻译错误。m1Ψ和Ψ究竟如何影响mRNA疫苗的翻译过程，仍是一个机制研究活跃的领域。

由设计好的snoRNA片段引导、DKC1催化实现的提前终止密码子假尿苷化，能够实现翻译通读。这是一种基于RNA的策略，有潜力用于治疗由提前终止密码子突变导致的人类遗传病。近期一项研究利用特定mRNA转录本上的Ψ密码子（ΨGA、ΨAA或ΨAG），并结合能够选择性解码Ψ以掺入非经典氨基酸（ncAA）的工程化tRNA，在哺乳动物细胞中实现了非经典氨基酸的插入。这种创新方法无需改变基因，即可在体内将非经典氨基酸引入靶向蛋白。与传统的DNA密码子扩展相比，这种RNA密码子扩展（RCE）策略避免了基因操作，通过在mRNA层面引入遗传信息控制的新维度，将RNA修饰从“调控元件”转变为“编码元件”。因此，RCE有望拓展基于mRNA的疗法可用的非经典氨基酸种类，并为合成生物学提供新工具。

除翻译调控外，Ψ还以环境依赖的方式影响mRNA的剪接和稳定性。PUS酶可以在共转录过程中将U转化为Ψ，从而促进广泛的可变pre-mRNA加工。TRUB1的缺失会导致其mRNA靶标的半衰期缩短，表明TRUB1介导的Ψ修饰能够稳定这些转录本。这些效应很可能是由Ψ诱导的RNA结构变化及RNA-蛋白相互作用所驱动。然而，在体内介导这些效应的RNA结合蛋白仍有待鉴定。此外，在染色质相关非编码RNA上也检测到丰富的Ψ位点，因此阐明其在染色质调控中的潜在作用将是未来的重要研究方向。

随着精准高通量测序方法的近期突破，预计对PUS酶在不同RNA种类上催化的假尿苷化进行全面功能表征的研究将加速推进。具体而言，动物模型和人类遗传学数据显示，在多种生物学背景下，大多数PUS酶的缺失都会导致复杂的表型。鉴定出介导这些功能结果的关键Ψ位点和RNA结合蛋白，将是进一步阐明Ψ功能的关键。Ψ的生物学可能如同m6A一样多样且基础。

3.2.2.Nm

Nm修饰封闭了核糖的2′羟基，从而影响RNA结构并干扰RNA结合蛋白的结合。例如，mRNA 5′帽结构上的Nm可通过阻断核酸传感器结合来防止先天免疫反应激活，尤其是抑制RNA传感器RIG-I和四肽重复序列干扰素诱导蛋白1（IFIT1）通路。Nm调控RNA结构、翻译和稳定性。它能稳定配对螺旋构象，同时削弱多种与2′羟基相互作用的RNA结合蛋白的结合。rRNA特定位点的Nm对于多个内部核糖体进入位点（IRES）的高效翻译至关重要。在mRNA中，编码区内部的Nm会干扰同源tRNA选择过程中的密码子读取关键步骤，从而调节翻译延伸。mRNA内部的Nm还与广泛存在的3′UTR缩短现象相关，这是一种全局性增加mRNA稳定性的机制。文章近期发现Nm也存在于染色质相关RNA（caRNA）上。一个潜在的Nm结合蛋白——剪接因子上游元件结合蛋白1（FUBP1），主要结合内含子区域的Nm，并在细胞核中介导Nm依赖性的剪接调控。未来需要进一步研究以鉴定更多的效应因子，特别是那些识别mRNA和caRNA上Nm位点的因子，并表征其相互作用的功能。

3.2.3.m5C

tRNA反密码子环或可变环上的m5C可防止内切核酸酶切割导致的tRNA片段化，而在rRNA中，m5C则维持核糖体结构稳定性，从而促进翻译。在mRNA中，m5C结合蛋白调控其甲基化靶标的代谢，包括核输出、稳定性、剪接和翻译。m5C及其相关蛋白已被证实参与多种生理和病理过程。

3.2.4.m7G

mRNA 5′帽结构上的m7G已知能够稳定转录本，并调控转录延伸、剪接、多聚腺苷酸化、核输出和翻译等过程。内部mRNA m7G已被证明可提高翻译效率。近期研究还鉴定出mRNA内部m7G的结合蛋白。例如，已知的m6A阅读蛋白IGF2BP蛋白也能结合m7G，其中IGF2BP3可促进癌症中带有m7G标记的致癌转录本降解。鉴于其正电荷的独特性，m7G可能改变RNA结构并影响蛋白-RNA相互作用，其中可能涉及芳香环堆积和相分离。事实上，Quaking蛋白（QKI）能优先识别m7G，并将带有m7G标记的转录本与G3BP1一同运送到应激颗粒中，从而在应激条件下调控mRNA的稳定性和翻译。

3.2.5.其他RNA修饰

其他已报道的内部mRNA修饰包括肌苷（I），以及较少见的N1-甲基腺苷（m1A）、N4-乙酰胞苷（ac4C）和5hmC。尽管它们的功能相关性及潜在机制尚未完全阐明，但这些修饰已被认为与RNA加工、细胞定位和mRNA翻译等过程有关。一个值得注意的例子是RNA腺苷-to-肌苷（A-to-I）编辑，由作用于RNA的腺苷脱氨酶（ADAR）催化。RNA编辑不仅能改变RNA的命运，还能使其序列相对于参考基因组发生变化。A-to-I编辑发生在mRNA、tRNA和miRNA中，尤其在含有反向Alu重复序列的非编码区中富集。编码区内的编辑可实现密码子“重编码”，产生功能不同的蛋白质异构体，从而扩展蛋白质组多样性。

自2020年以来，表观转录组学领域的一个范式转变性进展是发现了RNA修饰在染色质和转录调控中的关键作用。诸如m6A和m5C等修饰频繁地发生在增强子RNA（eRNA）、启动子相关RNA（paRNA）以及由重复元件转录而来的RNA（重复RNA）上，这些RNA被统称为染色质相关调控RNA（carRNA）。每种修饰都会招募特定的结合蛋白，这些结合蛋白进而与染色质调控因子或核内RNA降解系统相互作用，从而调节局部染色质状态和转录过程。

从概念上讲，carRNA的功能类似于组蛋白尾巴，充当模块化的生物大分子：它们携带着编码表观遗传信息的化学修饰，但与组蛋白尾巴不同的是，carRNA同时还具有内在的序列特异性。嵌入在特定基因座不同序列背景中的修饰，会被阅读蛋白解码，进而招募多种染色质效应因子，包括组蛋白修饰酶、DNA甲基化酶、转录因子、核心转录系统以及调控carRNA更新的复合物，从而协同完成染色质和转录调控（图3）。

图3. carRNA上的RNA修饰介导的染色质和转录调控

特别值得注意的是，重复RNA上的m6A通常会对这些重复元件起到抑制作用。重复元件占哺乳动物转录组的50%以上，并且常常位于编码基因内部或其附近。这些重复RNA上的m6A可能充当主调控开关，整合多个转录因子网络，在发育过程中或响应外界刺激时，协调成百上千个基因的表达。

一个颇具说服力的假说是，重复RNA上的m6A最初可能是作为一种防御机制，用于对抗逆转录转座元件的活性。这一原理可以解释为何重复RNA上的m6A既能招募核内RNA降解系统以清除转录出的重复RNA，也能招募组蛋白修饰酶在附近的组蛋白尾部沉积抑制性标记，这与人类沉默中枢（HUSH）通路抑制逆转录转座子元件激活的机制相似。在进化过程中，随着其中一些逆转录转座子逐渐适应宿主基因组，并在调控宿主基因表达方面获得新功能，这些与m6A相关的通路也协同演化为转录调控机制，不仅在不同细胞背景下发挥转录抑制作用，也发挥转录促进作用。

这一机制与mRNA m6A在转录后水平上将成百上千个mRNA聚集起来以实现快速更新和转录组重编程的方式类似。通过进化过程中普遍存在于基因组各处的逆转录转座子，重复RNA上的m6A能够将其宿主基因或邻近基因——这些基因往往代表多个转录调控子——聚集起来，在细胞状态变化或主要信号事件发生时，实现协同的转录调控。虽然这种调控可能主要依赖于重复RNA的存在，但也涉及其他调控性非编码RNA，例如paRNA和eRNA。

2020年何川团队发现METTL3共转录地将m6A沉积到carRNA上，高水平的carRNA m6A与染色质凝集和转录抑制相关。其他四个实验室在2021年也观察到了这一现象。最近，何川团队进一步揭示，carRNA（特别是重复序列来源的RNA）也会发生m5C修饰并受其调控。与mRNA类似，这些修饰的调控作用很大程度上取决于下游reader通路如何解读carRNA修饰并执行其功能。

在小鼠胚胎干细胞（mESC）中，carRNA上的m6A会招募核内m6A结合蛋白YTHDC1，而YTHDC1进而与核外切体靶向（NEXT）复合物结合，促进甲基化carRNA的降解，从而增强染色质凝集和基因沉默（图3A）。相比之下，在某些人类癌细胞中，YTHDC1与带有m6A标记的eRNA和paRNA结合，可阻断整合子（Integrator）依赖的提前转录终止，维持高效转录。与YTHDF2协同作用时，METTL3-METTL14介导转录本（来源于凋亡抑制蛋白（IAP）及相关内源性逆转录病毒K（ERVK）元件）5′ UTR上的m6A甲基化，会导致这些RNA的不稳定。

近期研究发现，m6A还可修饰着丝粒RNA（cenRNA），尤其是在癌细胞中，这些修饰被组蛋白变体着丝粒蛋白A（CENPA）直接识别。cenRNA上的m6A甲基化上调可在S期稳定着丝粒上的CENPA，维护着丝粒完整性并促进肿瘤细胞增殖，由此揭示了一个治疗靶点。此外，有研究发现RNA结合蛋白PSPC1能将TET2招募至转录活跃位点（如内源性逆转录病毒ERV），通过TET2介导的RNA m5C氧化为5hmC，经组蛋白去乙酰化和RNA去稳定化来调控ERVL元件及相关基因的表达。

在急性髓系白血病（AML）中，YTHDC1在细胞核内诱导形成的凝聚体可保护m6A修饰的mRNA免受poly A尾外切体靶向（PAXT）复合物及外切体相关的RNA降解，这对维持白血病至关重要（图3B）。在缺氧、富含乳酸的环境中，YTHDC1发生乳酸化修饰，促进其在核内发生相分离，从而保护致癌转录本免受PAXT-外切体复合物的降解。此外，YTHDC1还能结合eRNA上的m6A，并与BRD4发生相分离，促进转录凝聚体的形成，从而增强增强子功能并激活基因表达（图3B）。

值得注意的是，YTHDC1展现出多样化的、环境依赖性的carRNA m6A解读模式。在mESC中，它通过招募NEXT复合物来驱动甲基化carRNA的快速更新，从而将RNA降解与异染色质形成相偶联；同时，它结合特定的带有m6A标记的重复RNA（如IAP、ERVK和长散布元件1（LINE-1）），招募SETDB1以沉积抑制性的H3K9me3（图3C）。类似的YTHDC1-SETDB1轴也存在于K562细胞和HSPC中，在这些细胞中，m6A富集于复合型SINE-VNTR-Alu（SVA）转座子RNA上，通过促进H3K9me3沉积并抑制H3K27ac来驱动转录抑制，从而调节二价染色质状态。这一机制可能与降解通路协同或并行发挥作用，共同介导染色质闭合和转录抑制。相反，在mESC中，YTHDC1与共转录pre-mRNA上的m6A结合，基因会招募KDM3B，导致H3K9me2去甲基化，进而激活基因表达。此外，L1PA上的m6A可调控KAP1和EP300的招募，从而调节与8细胞相关的长末端重复序列（LTR）的染色质状态，进而抑制初始hESC中全能性样表型的出现。

因此，YTHDC1作为一个多功能分子枢纽，通过与多种效应蛋白的相互作用（这些相互作用由带有m6A标记的carRNA的基因组位置和细胞环境共同决定），介导对染色质状态和转录的多样化下游效应。此外，由不同生物学环境下的翻译后修饰可能决定的相分离，构成了YTHDC1调控的另一个层次。除YTHDC1外，RBFOX2也被鉴定为一种carRNA m6A结合蛋白。在白血病细胞中，RBFOX2结合基因启动子区域的m6A，并通过YTHDC1-PRC2（多梳抑制复合物2）轴促进H3K27me3介导的异染色质形成，从而导致RBFOX2结合位点处的转录抑制（图3C）。靶向RBFOX2会削弱AML细胞的存活并促进其向髓系分化。

FTO能够主动去除carRNA（特别是LINE1 RNA）上的m6A甲基化，从而减少YTHDC1的结合，增加局部染色质的可及性，并以顺式方式激活邻近基因（图3A和3C）。这种FTO-LINE1调控轴在mESC、多种组织以及小鼠早期发育过程中是保守的，其中高水平的FTO表达与超过一千个包含LINE1元件的基因的激活相关，这些基因大多与发育相关。利用dCas13b-FTO进行靶向LINE1 m6A去甲基化，能够很大程度上挽救FTO缺失细胞中观察到的缺陷，确立了FTO-LINE1通路是驱动与FTO失调相关发育表型的关键因素。

很可能通过类似的重复RNA m6A通路，将FTO基因异源导入水稻和马铃薯中，在田间试验中显著促进了根系生长，并使作物产量提高了50%。这些植株表现出根系伸长、分蘖数增加、光合作用增强及抗逆性提高。机制研究表明，FTO介导的carRNA m6A去甲基化诱导了整体转录水平的上调和染色质的开放。值得注意的是，藻类FTO的过表达（而非人源ALKBH5）似乎在植物中也能诱导类似的效应。

FTO在哺乳动物和多种藻类中保守，但在植物中不存在。尽管植物具有ALKBH5的同源蛋白（如ALKBH9B和ALKBH10B），但无论是人源ALKBH5还是其植物同源蛋白，均无法像哺乳动物FTO那样显著促进植物生长。结构分析揭示，ALKBH5及其植物同源蛋白中含有一个C端低复杂度区（C-LCR），而FTO缺乏该区域；该区域可诱导凝聚体形成（例如在哺乳动物中与外显子连接复合物EJC共凝聚），从而将ALKBH5限制于特定底物，阻止其对大多数carRNA发生广泛去甲基化。因此，虽然全长ALKBH5无法在mESC或植物中诱导全局染色质开放，但表达截去C-LCR的ALKBH5突变体则能引起全局carRNAm6A去甲基化和转录激活。这种C端截短的ALKBH5以及截短的植物同源蛋白，也能以类似于哺乳动物FTO的方式促进植物生长。由此可见，去甲基化酶通常驱动染色质开放和转录激活，但其活性受到严格调控：FTO通过与特定染色质因子结合来调控，而ALKBH5则通过凝聚体形成来调控。

此外，m6A甲基转移酶还可以不依赖于m6A甲基化来调控染色质和转录。例如，METTL3和METTL14在衰老相关分泌表型（SASP）基因处促进增强子-启动子环化，从而在衰老过程中在转录水平上促进SASP的表达。METTL14还能结合H3K27me3并招募KDM6B，以不依赖于METTL3或m6A的方式介导H3K27me3去甲基化；METTL14的缺失会增加全局H3K27me3水平并抑制基因表达，这对于mESC从自我更新向分化的转变至关重要。

除m6A外，m5C已被鉴定为carRNA上参与染色质调控的第二种修饰。机制上，染色质相关逆转录转座子RNA上的m5C被甲基-CpG结合结构域蛋白6（MBD6）所识别。MBD6是甲基-CpG结合结构域家族的一员，它通过BAP1去泛素化酶复合物及接头蛋白ASXL1，促进H2AK119ub的去泛素化，从而诱导染色质可及性增加（图3D）。TET2通过氧化m5C来拮抗这一调控轴；TET2的缺失会导致全局H2AK119ub水平下降、染色质更加开放以及转录水平升高（图3D）。该轴在TET2突变型白血病中至关重要，因为在小鼠模型中，MBD6的缺失可抑制突变细胞增殖并逆转造血缺陷，这使MBD6及BAP1招募通路成为治疗TET2突变或TET2缺失型恶性肿瘤以及TET2突变型CHIP（意义未明的克隆性造血）的潜在治疗靶点。值得注意的是，尽管MBD6及其同源蛋白MBD5属于甲基-CpG结合结构域家族，但它们的功能与识别DNA 5mC的经典MBD蛋白不同。MBD5和MBD6实际上作为RNA结合蛋白，优先识别RNA m5C。虽然MBD6在造血过程中发挥关键作用，但MBD5的突变与MBD5相关神经发育障碍（MAND）有关，该疾病以智力障碍和发育迟缓为特征，提示MBD5对RNA m5C的识别在神经系统中具有功能意义。

NSUN2已被鉴定为负责carRNA m5C沉积的甲基转移酶。在药理学上，使用5-氮杂胞苷（5-azaC）处理可抑制NSUN2活性，从而去除染色质相关重复RNA上的m5C。与5-azaC作为DNA低甲基化剂的经典作用相反，它还通过RNA依赖性途径发挥作用，导致转录抑制和细胞功能失调。通过去除重复RNA上的m5C，5-azaC削弱了MBD6的结合及随后的BAP1招募，从而阻止H2AK119ub的去除。与此同时，carRNA m5C的缺失还破坏了SRSF2的染色质靶向、p300的招募以及H3K27ac的沉积。这些发现强调了RNA依赖性通路在细胞对5-azaC应答中的重要性，并为预测疗效和开发新的治疗策略提供了新见解。

与其他TET家族成员不同，TET2缺乏DNA结合结构域，因此依赖蛋白伴侣来实现对carRNA的靶向。值得注意的是，TET1和TET3在胚胎发育后可产生较短的、缺乏DNA结合结构域的异构体，这引发了一个问题：这些异构体是否也能靶向RNA。未来的研究可能会平行聚焦MBD6、MBD5以及其他m5C结合蛋白的功能鉴定。综上所述，现有证据表明，虽然m6A作为广泛分布的转录调控因子在多种细胞类型中发挥作用，但像m5C这样的其他修饰可以在特定细胞谱系（如造血细胞和神经元细胞）中调控基因表达。

m6A结合蛋白已被证明可介导carRNA m6A与DNA 5mC之间的相互作用，以协调染色质和转录调控。在特定的癌症背景下，RNA结合蛋白FXR1识别RNA m6A，并招募DNA去甲基化酶TET1以去除特定基因组位点的DNA 5mC，从而重编程染色质状态和基因转录（图3E）。在hESC中，YTHDC2引导TET1至带有m6A标记的LTR7/HERV-H位点，以去除DNA 5mC并防止表观遗传沉默，最终通过抑制hESC的神经分化来维持多能性（图3E）。

这种相互作用也发生在writer之间：METTL3-METTL14与DNA 5mC甲基转移酶DNMT1发生物理相互作用，以引导基因DNA甲基化，导致RNA m6A和DNA 5mC在共享位点共存（图3E）。有趣的是，虽然m6A促进RNA的转录后降解，而基因5mC则增强转录，这两种相反的作用精细地调节了基因表达，并调控胚胎干细胞（ESC）中关键分化基因的表达。

多种调控性RNA保留在染色质上，包括源自增强子和启动子的非编码carRNA（按基因组背景分类），以及从重复元件转录而来的重复RNA（按基因组来源分类）。由于其高拷贝数、成簇分布以及部分自我互补性，这些重复RNA能够作为顺式调控元件、促进染色质环化的增强子，或促进转录凝聚体形成的因子发挥作用。

类似于组蛋白尾巴整合多种修饰来调控染色质状态，carRNA可能携带多种化学标记，在特定基因座独立或协同调控基因表达，形成一个复杂的调控网络。重复RNA（如LINE1）经常发生m6A和m5C修饰，而其他修饰，包括Ψ、Nm、m7G、m1A和m3C，也可能发生在特定的carRNA上，介导染色质调控（图3F）。由环境应激（如紫外线、特定化学物质）诱导的RNA损伤（例如U-U光产物和8-氧代鸟嘌呤）也可能影响染色质状态，引发转录应答。

重复RNA m6A调控系统的一个关键特征是其协调成百上千个基因转录的能力。m6A最初作为一种宿主防御机制进化而来，用于抑制逆转录转座子来源的RNA。随着这些元件后来被宿主基因组“驯化”为调控枢纽，这些逆转录转座子转录本上的m6A甲基化被用于沉默邻近基因并维护基因组稳定性。在进化过程中，这一功能通过多样化的m6A结合蛋白扩展，从而也促进了基因激活。最终，这一机制延伸至mRNA的转录后层面，形成了一个集成的转录与转录后调控网络。

除通过直接结合介导carRNA m6A调控的YTHDC1和RBFOX2之外，其他RNA结合蛋白也可能通过m6A甲基化诱导的RNA二级结构变化来间接识别carRNA m6A。整合分析ENCODE ChIP-seq和RBP eCLIP-seq数据与carRNA m6A位点，提示了其他潜在结合蛋白，其中AGO1/2和异质核核糖核蛋白（HNRNP）（可能通过m6A依赖的RNA结构转换机制）成为候选者。需要注意的是，许多表观遗传因子（如EZH2）也能结合染色质上的RNA，尽管这种结合通常是弱且非特异性的。它们可能通过与reader RBP的蛋白质-蛋白质相互作用，参与或受carRNA修饰的影响。未来需要进一步研究以确定特定的RNA m6A reader如何与表观遗传因子协同作用，在特定基因座调控染色质状态和基因转录，以及这些通路如何在发育和疾病中作为抑制因子或激活因子发挥作用。

作为RNA修饰的补充，文章提出carRNA内部的二级结构以及小非编码RNA对carRNA的特异性识别，构成了额外的调控性RNA元件，能够招募RNA结合蛋白及其相互作用的染色质因子，以实现局部染色质状态和转录的调控（图4）。

图4. 染色质和转录调控中出现的RNA调控元件

独特的RNA二级结构（如双链、茎环、G-四链体和假结）影响RNA的合成、剪接、稳定性和翻译。这些结构可能作为动态支架，调控特定基因组位点上蛋白质与染色质因子的相互作用。例如，LINE1 RNA可以反式作用，通过招募核仁素（nucleolin）和KAP1/TRIM28来抑制双同源框（Dux）和rDNA的转录，从而调控2-细胞标志基因网络。此外，G-四链体可招募核仁素，也可能招募tRNA片段（tRF）以进行转录调控。这些二级结构及其与RNA结合蛋白的识别，可能通过RNA修饰得到进一步调控。

与此同时，小非编码RNA，例如piwi相互作用RNA（piRNA）、内源小干扰RNA（endo-siRNA）、微小RNA（microRNA）、小核仁RNA（snoRNA），以及源自丰富非编码RNA（如tRNA和rRNA）的片段，可能结合carRNA的特异性序列，并将染色质因子引导至特定基因组位点，从而调控邻近的染色质状态和局部转录。已知这些小RNA携带多种修饰，这些修饰可能调节其生物发生和功能。近期证据表明，除了作为细胞质抑制因子的经典功能外，miRNA在细胞核中也具有激活作用。含有AAGUGC种子的miRNA可以引导AGO1/2靶向甲基化的carRNA，这一过程由m6A读取器FXR1/2介导，它们将AGO-miRNA复合物桥接到甲基化位点。这种双锚定复合物随后招募染色质重塑因子SMARCA4（BRG1）和DNA去甲基化酶TET1，以增加局部染色质可及性并激活转录。

总体而言，这些RNA调控元件被特定的RNA结合蛋白识别，随后通过多种效应蛋白（如组蛋白修饰酶、染色质重塑复合物、转录因子和凝聚体介导因子）发挥功能，形成一个复杂且高度互联的调控网络。这种carRNA介导的调控与组蛋白尾巴或DNA介导的调控相比有两个关键特征：（1）RNA调控元件及其相关过程与转录紧密相连，主要影响转录活性区域；（2）RNA携带序列特异性的背景信息，能够以顺式作用为主，实现对单个基因座或一大组基因集的精准调控。解析它们各自的作用、相互作用及治疗潜力，为理解染色质调控开辟了新的未来方向。

自2010年RNA表观遗传学复兴以来，RNA修饰在基因调控领域取得了指数级增长。表观转录组学一个变革性的新前沿是探索carRNA修饰如何影响染色质与转录调控。YTHDF2-m6A轴的功能是在转录后水平上，将成百上千个基因分组，以促进细胞状态转变过程中的快速转录组切换。一个统一原则是：carRNA（尤其是重复RNA）上的m6A，可能以类似的方式被“驯化”，直接在转录水平上协调发育及其他生物学过程中庞大基因网络的调控。

在此背景下，核内m6A结合蛋白在carRNA的m6A调控中至关重要。虽然METTL3和FTO可能分别负责m6A的沉积与去除，但核内m6A结合蛋白（如YTHDC1）则确保对带有m6A标记的carRNA进行正确的下游识别，并随后招募染色质因子。除METTL3外，METTL16和METTL5也可能参与carRNA m6A的沉积。若干关键问题定义了该领域的未来走向：特定的m6A reader与染色质因子如何协同作用，以决定基因特异性的结果（激活还是抑制）？这些通路如何建立一种“表观遗传预激活”的染色质状态和转录记忆，从而在二次刺激时实现更快、更强的反应？此外，这些途径是否有助于染色质状态的表观遗传？最后，这些通路在生理环境中如何作为基因抑制因子或激活因子发挥作用，它们在人类疾病中的失调又如何为治疗策略提供依据？其他修饰（例如Ψ、Nm、m7G、m1A和m3C）也可能发生在carRNA上并介导染色质调控，但它们的具体作用、相互作用及治疗潜力，在很大程度上仍是未知领域。

在mRNA、carRNA、tRNA、rRNA及其他RNA种类的修饰机制与功能研究方面，也已取得了重要进展。值得注意的是，许多RNA修饰酶作用于tRNA，并调控tRNA片段的生物发生。已知这些tRNA片段能够调控翻译，也可能通过序列互补性反式引导染色质修饰因子至特定基因座来调控转录，这是未来十年一个充满前景的研究方向。其他小RNA，尤其是那些带有N-聚糖修饰（糖基化RNA）并呈现在活细胞表面的RNA，也引起了广泛关注。糖基化RNA存在于在多种哺乳动物细胞类型中，提示RNA在细胞外生物学中具有功能。未来研究有望深入探索糖基化RNA的生物合成、转运及其在细胞命运决定和细胞间通讯中的功能影响。