DDX49在脂肪变性肝细胞中发生相分离

为探究DDX家族成员是否在脂肪变性肝细胞中组装新型无膜细胞器或颗粒，研究人员首先利用RNA-Seq分析了其在肝脏中的表达情况。结果显示，共有24个DDX家族成员在肝脏中有明显表达（图S1A）。研究发现仅DDX49在肝细胞胞质中定位，并在油酸/棕榈酸（OA/PA）刺激下形成点状结构（图S1B），提示其可能在脂肪变性肝细胞中发生LLPS。

进一步通过免疫荧光染色、单细胞RNA测序（scRNA-Seq）及肝实质细胞分离实验，发现DDX49主要定位于肝脏的实质细胞中（图1A），且DDX49的表达水平均无明显变化（图S1H–S1K）。因此，该研究聚焦于阐明MASLD进程中DDX49在脂肪变性肝细胞中的功能，特别是其发生LLPS及组装颗粒结构的潜力。

利用外源标签标记的DDX49过表达实验发现，在OA/PA或蛋氨酸胆碱缺乏培养基处理下，DDX49在胞浆中形成凝聚体，而5% 1,6-己二醇处理可使其解聚（图1B），提示DDX49在脂肪变性肝细胞中发生LLPS。内源性DDX49也发生LLPS（图1C）。为明确DDX49形成的凝聚体是否具有液体性质，研究者进行了荧光漂白后恢复（FRAP）实验，发现GFP标记的DDX49在HHL5细胞中呈现快速荧光恢复（图1D），同时DDX49凝聚体表现出高效的裂变与融合行为（图1E、1F）。此外，体外DDX49液滴同样表现出快速的FRAP恢复以及裂变与融合行为（图S1V、S1W）。上述结果表明，DDX49在脂肪变性肝细胞胞浆中通过LLPS形成凝聚体。

MASLD进程中DDX49依赖IDR在脂肪变性肝细胞中发生相分离

序列分析发现，DDX49的C端结构域含有一个预测的IDR区（图S1X），其LLPS能力依赖于IDR结构域，且该结构域本身即可独立发生LLPS（图1H）。进一步分析显示，DDX49的IDR区包含多个疏水性氨基酸，其C端IDR-III区域存在两个独特的疏水基序HM1和HM2（图S1Z），缺失IDR-III区域可完全消除DDX49的LLPS能力（图S1AA），提示DDX49的疏水基序在其LLPS形成中发挥关键作用。

研究比较了DDX49凝聚体与已知胞内无膜细胞器的定位、大小及数量差异，发现DDX49凝聚体与SG、P-body、PML小体及U-body等已知颗粒结构均无共定位（图1I，图S1AB）。三维重建分析显示，DDX49凝聚体的尺寸大于SG（图S1AC、S1AD），提示其是一种新型颗粒结构。此外，在多种MASH肝脏模型中，均观察到内源性DDX49组装的颗粒结构形成（图1J）。因此，在MASLD及MASH病程中，脂肪变性肝细胞内DDX49通过其IDR结构域依赖的LLPS机制组装形成了一种新型颗粒。

花生四烯酸（AA）代谢物促进DDX49组装形成脂质诱导颗粒

为明确DDX49组装的颗粒结构是否由特定代谢物诱导形成，该研究对MASH肝组织进行了非靶向代谢组学分析，发现一系列代谢物显著升高（图S2A），其中AA代谢通路的富集最为显著（图S2B），包含四种上调最明显的代谢物：6-keto-PGF1α、PGF2α、12-keto-TH-LTB4、5S-HETE（图2A）。在MASLD和MASH肝组织以及OA/PA或MCD培养基处理的肝细胞中，这四种AA代谢物的升高进一步得到了验证（图S2C-S2G）。说明这四种AA代谢物可能是诱导DDX49组装颗粒的关键因子。

随后，研究分别用6-keto-PGF1α、PGF2α、12-keto-TH-LTB4、5S-HETE处理原代肝细胞，发现单独使用均不能诱导DDX49颗粒形成（图2B，图S2H、S2I）。然而，联合使用6-keto-PGF1α和PGF2α可显著诱导DDX49组装颗粒结构（图2B、2C，图S2I）。利用SPR技术，研究发现6-keto-PGF1α和PGF2α均可与DDX49蛋白结合（图2D、2E），且通过BLI分析进一步证实了这一结合（图S2M、S2N）。Pull-down实验证实，6-keto-PGF1α和PGF2α可下拉DDX49蛋白（图2F），且DDX49的IDR结构域介导了二者的结合（图2G、2H）。上述结果表明，AA代谢物6-keto-PGF1α和PGF2α协同诱导脂肪变性肝细胞中DDX49组装形成颗粒结构，该颗粒被命名为“脂质诱导颗粒”（LIG）。

参考应激细胞中SG的提取方法，该研究建立了从脂肪变性肝细胞中分离LIG的实验流程（图2I），并验证了DDX49在LIG中富集（图2J）。对分离获得的LIG进行代谢物检测发现，其中富集6-keto-PGF1α和PGF2α（图2K）。综上所述，AA代谢物6-keto-PGF1α和PGF2α协同诱导脂肪变性肝细胞中DDX49组装形成LIG。

为探究LIG组装在MASLD进展中的作用，该研究构建了肝细胞特异性Ddx49基因敲除小鼠（图S3A）。采用MCD饮食诱导的MASH模型，结果发现，肝细胞DDX49缺失并不影响脂质沉积、肝损伤及肝脏炎症反应（图S3D–S3L）。

然而，Ddx49肝细胞特异性敲除小鼠在MASH诱导下的肝纤维化显著加重，表现为胶原沉积增加和肝星状细胞（HSC）活化增强（图3A–3F）。这一结果提示，肝细胞DDX49缺失可能因LIG组装受阻，而加剧MASH诱导的HSC活化和肝纤维化。

为明确Ddx49肝细胞特异性敲除介导的肝纤维化加重是否确实源于LIG组装的破坏，研究进一步构建了肝细胞特异性缺失DDX49 IDR结构域的小鼠，该结构域是DDX49发生LLPS及组装LIG的关键区域（图S3M、S3N）。在这些小鼠中，脂质蓄积、肝损伤及肝脏炎症同样未见显著改变（图S3O–S3V），但MASH诱导的肝纤维化显著加重（图3G–3L），与Ddx49全敲除小鼠的表型一致。因此，DDX49 LLPS活性的丧失可导致MASH诱导的HSC活化及肝纤维化加重，提示脂肪变性肝细胞中DDX49组装的LIG对MASH诱导的肝纤维化具有负反馈抑制作用。

LIG招募促纤维化因子Timp2 mRNA并抑制其翻译

为探究脂肪变性肝细胞中LIG缺失如何增强HSC活化进而加重肝纤维化，研究者建立了肝细胞与HSC共培养体系（图4A）。考虑到肝细胞可通过分泌一系列细胞因子调控肝纤维化进程，研究检测了不同处理条件下肝细胞上清液对HSC活化的影响。结果显示，OA/PA处理的HHL5细胞及原代肝细胞的上清液均可诱导LX-2 HSC细胞系及原代HSC的活化（图4B，图S4A–S4C）。过表达DDX49的HHL5细胞经OA/PA处理后，其上清液抑制LX-2细胞活化（图4C，图S4D、S4E）；而OA/PA处理的DDX49敲除的原代肝细胞上清则促进原代HSC活化（图4C、4D，图S4F）。上述结果表明，肝细胞中LIG的组装可通过调控细胞因子的产生进而抑制HSC活化。

鉴于RNA常被招募进入细胞内组装的颗粒结构，对脂肪变性肝细胞中DDX49进行了RIP-Seq，共鉴定出289个富集mRNA（图4E）。同时，对OA/PA处理的正常肝细胞及敲除Ddx49的原代肝细胞上清液进行蛋白组学分析，共筛选出54个差异表达蛋白。将两组数据取交集，获得四个候选肝细胞因子：丙酮酸激酶M1/2（PKM）、乳酸脱氢酶B（LDHB）、肾连蛋白（NPNT）及金属蛋白酶组织抑制因子2（TIMP2）。其中，TIMP2在DDX49缺失后升高最为显著（图4E、4F）。

TIMP2作为已知的促纤维化肝细胞因子，研究证实其可诱导HSC活化并加重肝纤维化（图S4G–S4Q）。进一步检测发现，DDX49过表达抑制TIMP2产生，而DDX49缺失则促进其产生（图4G–4I）。在MASLD和MASH小鼠模型中，肝细胞DDX49缺失同样导致血清TIMP2水平显著升高（图4J），而中和TIMP2可消除由敲除Ddx49导致的肝纤维化加重现象（图S4T–S4AG）。因此，脂肪变性肝细胞中LIG组装通过抑制TIMP2的产生，进而抑制HSC活化及肝纤维化。

进一步地，通过RIP-RT-qPCR及RNA pull-down实验证实，OA/PA处理后Timp2 mRNA被招募进入DDX49组装的LIG中（图4K–4M）。通过Polysome profiling、Ribo-Seq证实敲除DDX49能促进Timp2 mRNA翻译（图4N，S4AN-S4AR）。此外，LIG的诱导物也能抑制Timp2 mRNA翻译，且该抑制作用在敲除DDX49后被消除（图S4AS、S4AT）。综上所述，脂肪变性肝细胞中组装的LIG通过招募Timp2 mRNA并抑制其翻译，减少TIMP2产生，进而在MASLD及MASH病程中反馈性抑制HSC活化。

DDX49作为LIG组装支架招募YBX1

由于DDX49在无脂质刺激及LIG组装情况下不能与Timp2 mRNA结合（图4K、4L），该研究进一步探究了Timp2 mRNA如何被招募进入组装的LIG。蛋白组学分析显示，LIG中富集了267个蛋白质（图5A）；同时，通过对脂肪变性肝细胞中DDX49进行IP-MS分析，鉴定出27个DDX49结合蛋白。两个数据集取交集获得三个候选分子：YBX1、RPS25和NCL（图5A）。IP实验证实，OA/PA处理后DDX49与YBX1结合最强，与RPS25和NCL的结合相对较弱（图5B）。DDX49与YBX1的互作在体外（图S5A–S5D）及体内MASLD和MASH肝脏中（图5C）均得到证实。LIG分离实验进一步确认DDX49和YBX1均被包裹其中（图S5G）。上述结果表明，脂质蓄积诱导DDX49与YBX1结合，二者共定位于LIG中。

免疫荧光分析显示，DDX49与YBX1在肝细胞胞浆中呈弥散分布，OA/PA处理后二者共定位并共同进入DDX49标记的LIG（图5D，图S5H、S5I）。在DDX49缺失的肝细胞中，OA/PA诱导的YBX1聚集现象消失（图5D，图S5H、S5I）。相反，YBX1缺失并不影响OA/PA诱导的DDX49 LIG组装（图S5J、S5K）。体外实验表明，纯化的YBX1不能自发形成凝聚体，但加入DDX49后可发生凝聚（图S5L）。这些数据提示，YBX1是细胞内LIG的另一个标志分子，而DDX49作为支架蛋白驱动脂肪变性肝细胞中LIG的组装。

YBX1与Timp2 mRNA结合并抑制其翻译

为探究YBX1在MASLD和MASH进程中的作用，该研究构建了肝细胞特异性敲除YBX1小鼠。与DDX49敲除小鼠类似，YBX1缺失对脂质蓄积、肝损伤及肝脏炎症均无显著影响（图S5P–S5X），但MASH诱导的HSC活化及肝纤维化显著加重（图5E–5I，图S5Y）。敲除YBX1的肝细胞中，OA/PA诱导的DDX49 LIG组装未受影响（图5J，图S5Z），进一步证实DDX49作为LIG组装支架的功能。因此，DDX49与YBX1在脂肪变性肝细胞中相互结合并共同定位于LIG，二者协同反馈抑制MASH诱导的HSC活化及肝纤维化。

进一步研究发现YBX1过表达可减少TIMP2产生，而YBX1缺失则促进TIMP2产生，且Timp2 mRNA水平不受影响（图5K，图S5AA–S5AF），这一调控模式与DDX49一致。在MASLD和MASH小鼠模型中，Ybx1肝细胞特异性敲除小鼠血清TIMP2水平亦显著升高（图5L）。因此，与DDX49相似，YBX1可抑制TIMP2的产生。

作为m5C修饰的识别蛋白，YBX1具有结合RNA的能力。研究发现，YBX1在OA/PA处理前后均与Timp2 mRNA持续结合（图5M），且YBX1同样可抑制Timp2 mRNA的翻译（图5N，图S5AK–S5AM）。进一步研究发现，YBX1与Timp2 mRNA的结合不受DDX49缺失影响（图S5AN），但在YBX1缺失的肝细胞中，DDX49组装的LIG中不再富集Timp2 mRNA（图S5AO）。此外，无YBX1时，DDX49组装的LIG也不抑制Timp2 mRNA翻译（图S5AP）。综上，YBX1与促纤维化的Timp2 mRNA结合，二者共同被DDX49组装的LIG招募，进而抑制Timp2 mRNA翻译，反馈性抑制MASH诱导的HSC活化及肝纤维化。

LIG招募m5C修饰的Timp2 mRNA并抑制其翻译

鉴于YBX1作为m5C识别蛋白且与Timp2 mRNA结合，该研究进一步探究二者的结合是否依赖于Timp2 mRNA的m5C修饰。通过m5C-MeRIP-Seq及m5C-MeRIP-qPCR，在肝细胞中鉴定出Timp2 mRNA存在丰富的m5C修饰（图6A、6B，图S6A），Bis-Seq进一步明确了m5C修饰位点（图6A）。此外，DDX49或YBX1缺失并不影响Timp2 mRNA的m5C修饰水平（图S6C、S6D）。表明Timp2 mRNA的m5C修饰，可能是其与YBX1结合并被招募进入LIG的基础。

免疫荧光分析显示，在脂肪变性肝细胞中，内源性DDX49、YBX1、m5C修饰RNA及Timp2 mRNA共同定位于LIG内（图6C–6F，图S6E、S6F），提示YBX1及其结合的m5C修饰Timp2 mRNA被招募进入LIG。

为明确LIG对Timp2翻译的抑制是否依赖于m5C修饰，该研究敲低m5C甲基转移酶NSUN2，降低Timp2 mRNA的m5C修饰水平（图S6H-S6M）。发现NSUN2敲低导致Timp2 mRNA与YBX1的结合消失（图6G，图S6N），进而阻止Timp2 mRNA被招募进入LIG（图6H，图S6O）。在肝细胞中，NSUN2敲低后Timp2 mRNA翻译效率及TIMP2蛋白产生均增加（图6I、6J），且DDX49或YBX1缺失不能进一步增加其翻译（图S6P–S6S、S6V-S6W）。在DDX49或YBX1缺失背景下，NSUN2敲低亦不能进一步增强Timp2 mRNA翻译及TIMP2产生（图6K、6L）。上述结果表明，LIG对Timp2 mRNA翻译的抑制依赖于其m5C修饰。

LIG在人类脂肪变性肝细胞中组装并与肝纤维化进程呈负相关

为明确MASLD及MASH患者肝细胞中是否存在LIG，该研究对正常人肝脏、脂肪变性肝脏及MASH肝脏的组织切片进行了DDX49染色（图S7A–S7D）。结果显示，脂肪变性肝脏及MASH肝脏的肝细胞中存在LIG组装，而正常肝脏中几乎检测不到（图7A–7C，图S7E–S7G）。此外，在人脂肪变性肝及MASH肝组织中，YBX1及TIMP2 mRNA均被招募进入DDX49组装的LIG内（图7D–7F，图S7H、S7I）；DDX49在脂肪变性肝及MASH肝脏中与YBX1及TIMP2 mRNA结合，在正常肝脏中则无此结合（图S7J、S7K），而YBX1在三种肝组织中均与TIMP2 mRNA结合（图S7K）。

为进一步分析MASH病程中肝细胞LIG组装是否与患者肝纤维化进程相关，该研究对肝脏切片中的LIG进行了定量分析（图7G），并检测其与MASH患者肝纤维化评分的相关性。相关性分析显示，肝脏切片中LIG数量与高NFS评分及高FIB-4评分呈负相关（图7H、7I），提示肝细胞中LIG组装与MASH患者肝纤维化进展呈负相关。此外，MASH患者肝脏切片中观察到的LIG数量与血清TIMP2水平亦呈负相关（图7J），这支持了在小鼠模型中发现的LIG抑制肝细胞TIMP2翻译的结论。因此，人MASH肝脏中组装LIG可能提示发生肝纤维化及肝硬化风险较低，这与小鼠模型中观察到的LIG对MASH诱导纤维化的负反馈抑制作用一致。

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