《Advanced Materials》|IF29.4云序生物m7G RNA修饰测序赋能，双靶向表观遗传纳米药物克服骨肉瘤耐药！

TRAC-Seq：单碱基m7G 修饰tRNA测序（TRAC-Seq）

Ribo-Seq：翻译组测序（Ribo-Seq）技术

mim-tRNA-Seq：云序新品——氨酰-tRNA测序（mim-tRNA-Seq）技术

最近出现的证据表明，tRNA m7G修饰和组蛋白去乙酰化在多种癌症类型中促进肿瘤进展并降低化疗敏感性，例如在肝细胞癌中敲低METTL1可通过抑制表皮生长因子受体信号通路恢复敏感性，而在急性髓系白血病中抑制HDAC可通过诱导组蛋白高乙酰化增强化疗疗效。

为阐明它们在骨肉瘤中的作用，研究团队首先分析了临床样本中METTL1和HDAC1的表达情况，并通过整合多组学数据与生存分析评估了其预后意义（图1a）。在13对骨肉瘤及癌旁正常组织和TCGA-GTEx数据集中均显示，METTL1和HDAC1的mRNA在肿瘤组织中明显上调表达（图1b）。基于组织芯片（TMA）的免疫组织化学技术结果与mRNA表达谱一致（图1c,d）。临床数据中，METTL1和HDAC1表达升高的患者，其事件无进展生存期（EFS）显著缩短（图1e）。这些结果凸显了METTL1和HDAC1是驱动骨肉瘤恶性表型的关键表观遗传调控因子。

为评估这两种调控因子在以DOX为基础的化疗中的影响，团队分析了一个包含DOX敏感型和DOX不敏感型亚组的临床队列。首先在DOX不敏感患者的肿瘤组织中检测到METTL1和HDAC1的显著上调，表明这些调控因子驱动的表观遗传调控导致了化疗敏感性降低（图1f）。此外，研究团队观察到骨肉瘤中METTL1/HDAC1与TOP2A之间存在明显的正相关（图1g,h）。这些数据暗示METTL1和HDAC1的表观遗传调控可能与DOX介导的肿瘤抑制密切相关。并且METTL1与HDAC1表达之间存在强正相关，暗示了它们的表观遗传调控机制之间可能存在串扰（图1i）。

为描绘这两种调控因子在肿瘤微环境内的表达全景，研究团队利用骨肉瘤的单细胞转录组测序数据分析了表达谱。根据已确立的标志性基因，总共鉴定出11个细胞亚群（图1j,k）。UMAP与点图分析显示，METTL1和HDAC1在DOX不敏感的肿瘤组织中均上调，但它们的表达模式在不同细胞亚群间存在差异（图1l,m）。除了在骨肉瘤细胞中表达显著外，METTL1在成纤维细胞和破骨细胞中也表现出明显的升高水平，突显了不同细胞对肿瘤微环境（TME）的独特贡献（图1l,m）。

图1. METTL1与HDAC1表达上调与骨肉瘤化疗敏感性降低相关

受前述结果启发，研究团队利用m7G修饰抑制剂siMETTL1和HDAC抑制剂BEL作为强效表观遗传调控剂，通过一种直接且通用的金属-有机配位自组装方法开发纳米表观药物。鉴于整合素αvβ3在骨肉瘤中的高表达，团队将DSPE-PEG2000-cRGD整合到配方中，以促进靶向递送。采用透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）观察发现，siMBD-R NPs呈均匀的球形结构，平均直径约150nm（图2a,b）。动态光散射分析(DLS)显示siMBD-R NPs的流体动力学尺寸略有增加，多分散指数（PDI）为0.08（图2c）。siMBD-R NPs在磷酸盐缓冲盐水和10%胎牛血清中储存一周后尺寸变化极小，表明其在生理条件下具有优异的稳定性（图2d）。元素分布图分析显示O、N、P、S和Mg元素在siMBD-R NPs中均匀分布，证实了不同成分已成功整合到纳米结构中（图2e）。团队同时检测了它的光物理性质，发现siMBD-R NPs在256 nm和500 nm处显示出明显的吸收峰（图2f），这可归因于纳米表观药物中siMETTL1/BEL和DOX的存在。荧光光谱进一步证实了这一结论（图2g）。血清稳定性实验表明，siMBD-R NPs中的siMETTL1在10% FBS中孵育7天后仍保留了超过78%的初始含量，而游离siMETTL1在10小时后几乎完全降解（图2h）。研究团队进一步探索了siMBD-R NPs中活性成分在不同条件下的释放曲线。如图2i所示，在中性条件下，48小时内仅有19.8%的Cy5标记的siMETTL1被释放；而在pH 5.5条件下，24小时内发生了81.1%的突释。这些结果与相应的TEM图像一致，证明了siMBD-R NPs的肿瘤酸性响应行为（图2j）。

为深入研究siMBD-R NPs的组装机制，研究团队使用GROMACS软件进行了分子动力学模拟。图2k提供了不同时间点siMBD-R NPs组装动态的详细快照，描绘了其从离散分子到组装聚集体的结构演变。在从0 ns到100 ns的模拟过程中，分子从随机分布状态转变为聚集结构。分子间相互作用分析揭示，siMBD-R NPs的形成主要由Mg²⁺与DOX和BEL之间的金属-有机配位键，以及siMETTL1、DOX和BEL之间的π-π堆积作用驱动（图2l）。

图2. siMBD-R纳米颗粒的制备与表征

为评估siMBD-R NPs的体外递送效率，研究团队首先比较了不同递送制剂的细胞摄取情况。与游离的Cy5标记的siMETTL1几乎可忽略不计的细胞摄取相比，siMBD NPs凭借其对siMETTL1的保护作用显著提高了摄取效率，而siMBD-R NPs则能通过DSPE-PEG2000-cRGD功能化赋予的与αvβ3整合素的靶向亲和力，进一步促进细胞摄取（图3a,b）。此外，siMBD-R NPs的细胞摄取表现出时间依赖性的增强（图3c,d）。

随后，研究团队使用LysoTracker选择性标记溶酶体，评估了负载Cy5标记siMETTL1的siMBD-R NPs的溶酶体逃逸能力。共孵育2小时后，红色与绿色荧光信号的共定位证实了siMBD-R NPs被内吞进入溶酶体（图3e,f）。在12小时时，观察到红绿荧光共定位显著减少，证明了siMBD-R NPs成功实现了溶酶体逃逸。

之后，研究团队探究了siMBD-R NPs在骨肉瘤细胞中引起的METTL1和HDAC1抑制效果。如图3g所示，游离siMETTL1显示出有限的METTL1敲低效率，而siMBD NPs和siMBD-R NPs实现了理想的蛋白质敲低能力。此外，负载HDAC抑制剂BEL使得该纳米表观药物具备优异的HDAC1抑制效果，证明了其进行表观遗传调控的潜力（图3h）。

图3. siMBD-R纳米颗粒的细胞摄取、溶酶体逃逸及蛋白抑制效能

为探究siMETTL1介导的m7G tRNA修饰和BEL触发的组蛋白乙酰化在恢复DOX化疗敏感性中的作用，研究团队使用CCK-8法评估了不同制剂对多种人骨肉瘤细胞系的杀伤能力。如图4a所示，所有治疗组均表现出一定程度的浓度依赖性细胞毒性。“DOX + siMETTL1”和“DOX + BEL”组合均显示出对DOX的适度增敏效果，尤其在较高浓度时更为明显，这凸显了siMETTL1或BEL各自的贡献。值得注意的是，siMBD-R NPs展现出最强的效力，在143B细胞中的IC50达到0.27 μM，显著低于游离DOX的IC50（1.61 μM）。克隆形成实验进一步证实，siMETTL1和BEL诱导的双重表观遗传调控能够协同增强化疗敏感性（图4b）。

研究团队采用流式细胞术检测143B骨肉瘤细胞经不同制剂处理后的凋亡情况，发现siMBD-R NPs处理导致了58.61%的细胞凋亡率，远超游离DOX组的7.54%（图4c）。DOX的细胞毒性主要源于其诱导的DNA损伤，其中DSB是最致命且最难修复的形式。考虑到这一点，团队采用彗星实验和γ-H2AX免疫荧光染色评估不同处理对DNA DSBs的影响。如图4d所示，经siMBD-R NPs处理的骨肉瘤细胞表现出明显更长的彗星尾，表明其DNA损伤增加。与信号不明显的DOX孵育细胞相比，内吞了siMBD-R NPs的细胞显示出显著且广泛的全核γ-H2AX磷酸化模式，证实了细胞核内存在高密度的DSBs（图4e）。

综上所述，siMBD-R NPs显著增强了DOX的化疗敏感性并引发了严重的DNA损伤，从而放大了针对骨肉瘤的治疗效果。

图4. siMBD-R纳米颗粒体外扩增的化学敏感性与DNA损伤

siMBD-R NPs强大的抗肿瘤活性可能源于其对表观遗传修饰的强烈影响。为此，研究团队评估了siMBD-R NPs诱导的表观遗传修饰水平变化。与游离DOX组相比，siMBD-R NPs能显著提高两种骨肉瘤细胞系中的H3K9和H3K27乙酰化水平，这可能归因于对组蛋白去乙酰化的抑制（图5a）。而siMBD-R NPs通过有效敲低METTL1，显著降低了tRNA m7G修饰水平（图5b）。

团队进一步利用TRAC-seq，实现对全局m7G修饰模式的单核苷酸分辨率分析（图5c）。共鉴定出26个在可变环区域具有“GGTTMR”motif序列的m7G修饰tRNA（图5d,e）。与对照组相比，siMBD-R NPs诱导的METTL1敲低显著降低了已鉴定tRNA的m7G甲基化分数（图5f）。同时，它还能导致大多数m7G修饰tRNA的表达水平出现不同程度的降低（图5g）。相比之下，非m7G修饰tRNA的表达基本不受siMBD-R NPs处理的影响（图5h）。

此外，团队进行了嘌呤霉素掺入实验，以评估m7G修饰是否影响骨肉瘤细胞中的翻译过程。结果发现siMBD-R NPs处理后的骨肉瘤细胞内的新蛋白质合成被显著抑制（图5i），表明siMBD-R NPs介导的METTL1敲低破坏了m7G tRNA修饰，进而导致相关tRNA表达和mRNA翻译受到抑制。

总体而言，siMBD-R NPs能够有效调控m7G tRNA修饰和组蛋白去乙酰化，实现双重表观遗传调控。

图5. siMBD-R纳米颗粒诱导的组蛋白去乙酰化、tRNA m7G修饰、tRNA表达及mRNA翻译的双重表观遗传调控

siMBD-R NPs诱导了新蛋白质合成的显著下降。为进一步鉴定受siMBD-R NPs介导的m7G tRNA修饰影响的下游mRNA靶标，研究团队对siMBD-R NPs处理组和对照组同时进行了Ribo-seq和RNA-seq分析（图6a）。测序结果显示，在143B细胞中鉴定出2627个翻译效率降低的基因和1354个翻译效率升高的基因（图6b）。分析结果显示，翻译效率降低的mRNA明显含有更高频率的m7G修饰tRNA携带的密码子（图6c）。这表明，siMBD-R NPs介导的METTL1敲低改变了m7G tRNA修饰，从而以一种密码子频率依赖性的方式调控靶标mRNA的翻译。

GO和KEGG分析结果表明，siMBD-R NPs组中翻译效率降低的基因，在与DNA修复调控相关的条目上显著富集（图6d，e）。GSVA分析显示，siMBD-R NPs处理后，包括碱基切除修复、双链断裂修复以及DNA损伤感应与信号传导在内的DNA损伤修复相关通路明显下调（图6f）。

Chk1/2是DNA损伤应答的关键介导因子，它们协调生物学过程并促进DNA修复。研究团队进行了RNC mRNA qPCR分析，结果表明siMBD-R NPs处理显著降低了CHEK1和CHEK2 mRNA的翻译效率，而敲低METTL1对其总体mRNA水平影响甚微（图6g）。与之相一致，在siMBD-R NPs培养后，可以观察到由CHEK1和CHEK2分别编码的Chk1和Chk2蛋白表达的强烈下调，以及其磷酸化水平的显著降低（图6h）。

总而言之，如图6i所示，siMBD-R NPs中的siMETTL1能有效下调METTL1，显著降低m7G tRNA修饰水平，并选择性调控mRNA翻译，最终抑制DNA修复蛋白的功能。同时，BEL促进了组蛋白乙酰化，导致染色质松弛和染色质可及性提高。因此，siMBD-R NPs介导的双重表观遗传重编程协同增强了DOX诱导的DNA损伤，从而提高了化疗敏感性并产生强大的抗肿瘤疗效。

图6. siMBD-R NPs介导的m7G tRNA修饰诱导DNA修复通路中翻译效率的负向调控

在系统评估了siMBD-R NPs的体外抗肿瘤性能并全面阐明了其潜在机制后，研究团队接着研究了其肿瘤靶向能力和体内生物分布。分别通过静脉注射将Cy5标记的游离siMETTL1、siMBD NPs和siMBD-R NPs给予携带143B皮下瘤的小鼠，并使用活体成像系统（IVIS）在不同时间点量化荧光强度，发现siMBD NPs显示出由于增强渗透与滞留效应而提高的肿瘤摄取量（图7a）。离体生物分布结果显示，siMBD-R NPs的肿瘤摄取量是游离siMETTL1的15.2倍（图7b,c）。

随后，研究团队在皮下异种移植小鼠模型（CDX）中探索了siMBD-R NPs的体内抗肿瘤效果。不同组别的小鼠每两天接受一次预定治疗，共五次，并在整个治疗过程中监测其肿瘤体积和体重变化（图7d）。结果显示，siMBD-R NPs组未观察到显著的体重变化（图7e），初步证实了纳米表观药物的生物安全性。此外，对照组和游离药物组由于快速清除和肿瘤蓄积差，表现出快速的肿瘤生长（图7f-h），siNBD NPs和siMBD NPs表现出一定程度的肿瘤抑制。同时，与游离DOX组相比，静脉注射siMBD-R NPs的小鼠呈现出显著增强的抗肿瘤效果，将肿瘤抑制率从10.8%提高到92.3%（图7f）。

研究团队进一步通过蛋白质印迹和免疫组织化学染色研究了肿瘤组织中表观遗传调控因子的表达水平。如图7i,j所示，siMBD-R NPs组表现出对METTL1和HDAC1表达的显著抑制，证实了其在体内的双重表观遗传重编程能力。H&E和TUNEL染色分别进一步验证了siMBD-R NPs处理小鼠中明显的坏死和增强的凋亡（图7k）。这些结果表明，与传统的DOX相比，所构建的具有双重表观遗传调控能力的纳米表观药物在骨肉瘤治疗中表现出显著改善的疗效。

图7. siMBD-R NPs在皮下细胞系来源的异种移植肿瘤模型中的体内生物分布和抗肿瘤活性

为更好地模拟骨肉瘤的临床特征，研究团队通过将143B细胞注射到小鼠胫骨平台，建立了原位CDX肿瘤模型。结果显示负载Cy5.5标记siRNA的siMBD-R NPs有效地在原位肿瘤内蓄积，在注射后约12小时荧光信号显著增强，并持续至约36小时（图8a）。与皮下瘤模型相似，离体成像显示siMBD-R NPs的肿瘤蓄积增强，相比之下，注射游离siMETTL1和siMBD NPs后的瘤内分布则有限（图8b,c）。

随后，研究团队通过每隔一天静脉注射不同制剂来评估siMBD-R NPs的治疗效果（图8d）。在治疗期间，每6天通过生物发光成像监测肿瘤进展（图8e,f）。与PBS或DOX处理的小鼠表现出快速肿瘤生长相比，siMBD-R NPs具有显著的肿瘤抑制效果，在整个治疗期间维持了最小的生物发光信号和持久的生长抑制，几乎完全抑制了肿瘤负荷。切除肿瘤的离体分析实验进一步证实了上述结果（图8g,h）。同时，各组均未观察到显著的体重变化，表明其优异的生物安全性（图8i）。

图8. siMBD-R NPs在原位CDX模型中的体内生物分布和治疗效果

PDX和PDO模型是根据患者来源的肿瘤组织建立的，可靠地再现了关键肿瘤特征，并密切模拟了肿瘤进展和演变。根据先前报道，研究团队利用接受过新辅助化疗的骨肉瘤患者的肿瘤组织，建立了骨肉瘤PDX和PDO模型，并进一步研究了siMBD-R NPs的抗肿瘤疗效（图9a）。与143B皮下瘤小鼠的结果一致，该纳米表观药物在抗肿瘤效果上优于游离DOX，显示出约91.1%的增强肿瘤抑制率，且对体重无显著影响（图9b-e）。类似地，经siMBD-R NPs处理的PDOs也表现出显著的体积缩小和结构瓦解（图9f）。细胞活力测定进一步证实了这一结论（图9g）。总体而言，siMBD-R NPs强大的抗肿瘤活性，为骨肉瘤的个体化治疗展现了有前景的临床转化潜力。

图9. siMBD-R NPs在 PDX 和 PDO 模型中的治疗有效性

为阐明siMBD-R NPs卓越的抗肿瘤功效是否与肿瘤微环境中的免疫重编程相关，研究团队对治疗后的原位骨肉瘤组织进行解离并进行流式细胞术分析。细胞毒性CD8+ T淋巴细胞（CTLs）是清除TME内恶性细胞的关键效应器。在此基础上，团队首先评估了肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）中CD3+CD8+ T细胞的比例。与对照组或游离DOX治疗组相比，siMBD-R NPs处理导致了CD3+CD8+ T细胞浸润的适度增加（图10a,b），CD3+CD8+ T细胞比例从10.0%显著上升至约21.0%。

随后，研究团队检测了CD4+ T淋巴细胞，它们通过为细胞毒性及其他效应细胞的活化、增殖和记忆形成提供关键辅助，在协调抗肿瘤免疫中发挥核心作用。与对照组相比，siMBD-R NPs处理使CD3+CD4+ T细胞增加了2.77倍（图10c,d）。同时，研究团队进一步评估了调节性T细胞（Tregs; CD3+CD4+CD25+Foxp3+）的比例，这是一群抑制抗肿瘤免疫应答并促进免疫逃逸的T细胞亚群。对照组中，Tregs约占CD3+CD4+ T细胞的15.1%，而siMBD-R NPs诱导其频率显著降低至约8.11%（降低约46%）（图10e,f）。

除调控适应性免疫外，siMBD-R NPs也增强了先天抗肿瘤免疫。对照组中M1型巨噬细胞仅占约9.7%。siMBD-R NPs将该比例提高至24.8%，同时减少了M2型细胞，这表明巨噬细胞表型从免疫抑制性向免疫刺激性转变（图10g,h）。树突状细胞是主要的抗原呈递细胞，在启动T淋巴细胞活化和增殖中至关重要。siMBD-R NPs显著加速了DC的成熟，表现为MHC II+CD11c+细胞比例从对照组的3.0%增加至27.4%，提升了9.13倍（图10i,j）。

综上所述，这些结果表明siMBD-R NPs对TME进行了多方面的免疫重塑，同时增强了细胞毒性和辅助性T细胞应答，减轻了免疫抑制，并增强了抗原呈递，从而强化了抗肿瘤免疫力。

图10. 不同处理后肿瘤微环境的体内免疫特征分析