该研究为检测glycoRNA，采用Ac4ManNAz处理细胞或组织培养物，使叠氮修饰的糖基能够整合到细胞多糖中。RNA提取纯化后，采用生物素标记探针进行点击化学反应对glycoRNA进行标记。随后通过RNA印迹法检测生物素标记的glycoRNA（图1A）。结果显示，在缺乏Ac4ManNAz标记的对照组中，或仅进行Ac4ManNAz标记而未进行后续点击化学反应时，几乎未观察到斑点。仅当两种标记方法同时应用时，糖基化RNA斑点才清晰可见，这表明标记具有特异性。此外，用唾液酸酶或核糖核酸酶A处理生物素标记的RNA后，糖基化RNA斑点的强度显著降低，证实了RNA分子发生了糖基化修饰（图1B）。作者在多种细胞系（鼻咽癌细胞HK1、CNE2、HNE1，肿瘤组织NPCPDX和B淋巴瘤细胞系P3HR1、Akata、Raji）中检测到glycoRNA信号，不同细胞类型糖基化RNA水平或状态可能存在差异（图1C-E）。

为探究糖基化RNA转录本的大小，作者纯化总RNA并通过10%至50%蔗糖密度梯度进行分级分离，最终获得14个独立分级。随后对各分级样本进行RNA沉淀处理（图1F）。密度梯度离心后，通过RNA印迹分析评估回收RNA转录本的糖基化水平（图1G–I）。糖基化RNA主要集中在0-2000 nt区间，该现象在CNE2、P3HR1和HNE1细胞系中均一致存在,这表明糖基化RNA的类型比已知范围更广。

图1. 上皮细胞和B细胞中的糖基化RNA

该研究建立了Clier-seq分析流程（图2A-C），首先提取并纯化总RNA，随后通过蔗糖密度梯度离心法按大小分离RNA转录本，重点关注小于2000 nt的片段。通过点击化学反应将RNA标记为生物素。实验保留了INPUT样本，并通过链霉亲和素磁珠富集glycoRNA，命名为ENRICH样本，随后对两个样本进行文库构建（UMI建库）和分析（图2A）。质控后将测序reads于多种参考序列进行比对，包括EBV基因组、rRNA、tRNA、mtRNA、snRNA、Y RNA及7SL RNA。最终将未比对读段与人类基因组参考序列GRCh38进行比对（图2C）。ENRICH样本与INPUT样本获得的reads数相对一致，其中超过93%的reads成功映射至目标基因组。

该标准化高效文库构建流程可在单日内完成富集至文库构建的全流程，实现糖基化RNA的快速检测。该研究成功保留了先前鉴定的大多数糖基化RNA候选转录本（大小介于50至200 nt的小非编码RNA），同时捕获了更多lncRNA和mRNA转录本。

图2. Clier-seq分析流程示意图

数据分析结果显示，部分富集的糖基化RNA转录本位于基因组未注释区域。此外，原论文（Flynn等，2021）存在若干问题：（i）比对率偏低；（ii）将单端比对方法错误应用于配对双端数据；（iii）在未进行标准化处理的情况下直接对原始reads计数进行差异分析。这些缺陷促使作者探索糖基化RNA分析的替代方法。为解决这些问题并全面鉴定糖基化RNA，该研究采用了HISAT2、StringTie和Ballgown工具（图2C），系统性修正了原论文中的问题。

火山图展示了ENRICH组中显著富集的RNA转录本，其中富集程度最高的转录本以红色标注于图谱的正倍比变化。值得注意的是，许多转录本未被注释由StringTie预测获得，表明存在先前未识别的糖基化RNA（图3A）。Ac4ManNAz标记细胞相较于INPUT组及阴性对照组（未标记Ac4ManNAz样本）均呈现表达峰值。这些峰值在不同细胞类型中具有一致性，且保持了序列保真度（图3B）。这些发现强调了转录本组装与预测在不同样本中识别糖基化RNA的重要性。研究还使用MACS2识别富集reads的糖基化位点对应区域，MACS2鉴定的转录本与HISAT-StringTie-Ballgown流程结果一致，进一步验证了该方法（图3C,D）。

图3. 通过Clier-seq分析流程鉴定glycoRNA

作者根据NCBI基因类型与状态、GeneCards分类等因素，将比对至基因组参考序列的RNA转录本划分为六类（排除tRNA、mtRNA、rRNA、snRNA、Y RNA及7SL RNA）。具体分类如下：(i) ncRNA（不含snoRNA），(ii) 未注释的RNA转录本（StringTie预测），(iii) 假基因及其他转录本，(iv) 蛋白质编码RNA，(v) 核糖体蛋白mRNA（RP mRNA），(vi) snoRNA。

对所有样本做火山图分析显示，Ac4ManNAz富集的转录本主要归属于未注释转录本类别（图4A），该结果与图3A所示一致。此外，通过Clier-qPCR技术在ncRNA、假基因和蛋白编码基因类别中鉴定并验证了若干高度富集的转录本，其中MSTRG.7832作为Clier-qPCR检测的阳性对照。vtRNA2-1富集程度最高（图4B）。Clier-qPCR验证了vtRNA2-1在P3HR1和CNE2细胞中高度富集，但在Akata细胞中未见富集（图4B和C），这可能与其在Akata细胞中的低表达水平有关（仅为P3HR1细胞的1/230）（图4D）。与Clier-qPCR结果一致，IGV图谱同样显示vtRNA2-1在P3HR1、Raji和CNE2细胞中特异性富集（图4E）。这些结果表明，vtRNA可能是糖基化修饰的候选靶标。

该研究发现了三个新glycoRNA（均由StringTie预测，图3A），用CPAT预测RNA编码潜力发现，这些转录本编码潜力较低且长度超过200 nt，命名为linc03118、linc03119和USP43-OT（图4F），这证实了lncRNA中存在糖基化现象。

图4. 6类RNA转录本中glycoRNA的鉴定

作者还对最初排除在比对之外的RNA转录本（如snRNA、Y RNA、7SL RNA、tRNA和mtRNA）进行了富集分析。值得注意的是，在火山图（图5A）中观察到tRNA转录本的富集现象，包括tRNA-Ser-GCT-4-2、tRNA-Thr-AGT-1-1和tRNA-Lys-TTT-7-1。为消除tRNA文库制备和测序过程中的偏倚，作者通过Clier-qPCR技术对目标转录本进行验证，结果证实其丰度显著高于阴性对照样本（图5B）。

研究通过IGV进一步分析了这些富集的tRNA转录本，其中同源成熟tRNA以蓝色（阳性）或红色（阴性）线条标注。分析显示，糖基化tRNA在所有细胞类型中均呈富集状态。部分tRNA的3′端比成熟tRNA更长（图5C）。为深入探究，研究对前体tRNA进行了Clier-qPCR检测。pretRNA-Lys-TTT-7-1、pretRNA-Val-CAC-3-1、pretRNA-AGT-1-1及pretRNA-Val-CAC-1-2等转录本在P3HR1、CNE2和Akata细胞中显著富集（图5D）。此外，前体tRNA的富集倍数显著高于成熟tRNA（图5E），表明tRNA糖基化可能也发生在前体tRNA阶段。

图5. tRNA糖基化分析

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