DNA修饰作为表观遗传调控的核心调控载体，以其动态可逆性及不改变DNA碱基序列即可调控细胞生物学功能的核心特性，始终是表观遗传学领域的研究热点。从经典的5-甲基胞嘧啶（5mC），5-羟甲基胞嘧啶（5hmC），到近年来逐步受到关注的5-甲酰基胞嘧啶（5fC）、5-羧基胞嘧啶（5caC）及N6-甲基腺嘌呤（6mA）等新型修饰类型，各类修饰的发现与功能解析均为揭示生命活动调控机制提供了关键视角。其中，5fC与5caC作为5mC的重要氧化衍生物，在胚胎发育的细胞分化编程、干细胞多能性维持等关键生理过程中发挥着“表观遗传开关”的核心调控作用；6mA修饰则突破了“仅存在于原核生物中”的传统认知，其在真核生物肿瘤发生发展、衰老进程及物种进化适应等场景中的调控功能，已成为科研工作者的重点探索方向。

本期我们将聚焦DNA修饰这一表观遗传核心领域，通过解析顶刊中的DNA新型修饰以及总结云序生物客户在该领域的研究成果，带大家深入解析5mC、5fC、5caC、6mA等关键修饰的生物学功能，同时揭秘云序生物DNA修饰测序技术如何为科研团队的研究提供坚实支撑。

• 背景

心肌线粒体功能障碍是心力衰竭（HF）发病机制的基础，但恢复心肌线粒体功能的治疗选择很少。线粒体 DNA（mtDNA）的表观遗传修饰，例如甲基化，在调节线粒体稳态中起着关键作用。最近的研究扩展了对线粒体表观遗传修饰的理解，揭示了线粒体DNA中的脱氧腺苷可以通过 METTL4甲基化成N6-甲基腺嘌呤（6mA），表明 6mA是 mtDNA 中除 5mC 之外的另一种甲基化类型。 线粒体DNA甲基化对线粒体功能的影响是深远的，特别是因为它们与各种疾病的发病机制有关。 尽管取得了重大进展，但线粒体DNA甲基化在线粒体生物学中的具体作用及其对心脏健康和疾病的影响仍然是有限的了解领域。研究者们通过研究线粒体DNA甲基化在心衰发病机制中的作用及其治疗潜力。

• 研究发现

核心现象发现：心力衰竭伴随心肌细胞mtDNA 6mA修饰的特异性升高

研究团队通过建立非缺血性及缺血性小鼠心力衰竭模型，并对分离自成年心肌细胞的mtDNA进行超高效液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析，实现了对DNA修饰的精准定量。数据显示，衰竭心肌细胞中mtDNA的6mA修饰水平呈现3至5倍的显著升高，而5mC修饰水平未发生显著改变。这一发现表明，mtDNA 6mA修饰是响应心脏压力应激的特异性表观遗传标记，与心力衰竭的病理过程紧密相关。

关键酶鉴定：METTL4被证实为线粒体定位的6mA甲基转移酶

为探究6mA修饰的上游催化机制，研究聚焦于甲基转移酶METTL4。通过亚细胞蛋白质印迹与免疫荧光共定位分析，证实在成年心肌细胞中，METTL4主要定位于线粒体。在分子层面，METTL4的mRNA与蛋白表达水平在心脏产后成熟过程中下调，而在心力衰竭时被重新激活，其表达动态与mtDNA 6mA丰度的变化趋势高度一致。在人类扩张型心肌病心力衰竭样本中也观察到METTL4的上调与mtDNA 6mA的积累，进一步验证了该通路的临床相关性。

机制解析：MeDIP-Seq揭示METTL4 通过催化mtDNA启动子区域中的 6mA 抑制转录复合物组装和mtDNA转录

为阐明6mA修饰影响线粒体功能的具体分子机制，研究人员采用了6mA-MeDIP-Seq，甲基化DNA免疫共沉淀测序技术。MeDIP-Seq分析结果显示，6mA修饰非均匀地显著富集于mtDNA的D-loop区，该区域包含线粒体基因组的重链与轻链启动子。这一关键定位提示6mA修饰可能直接作用于转录起始这一核心调控环节。为验证此假说，研究人员通过ChIP实验证实，甲基转移酶METTL4可直接结合于mtDNA启动子区域，且其结合强度在METTL4过表达时显著增强。更重要的是，当METTL4催化的6mA修饰水平升高后，后续的ChIP分析显示转录因子TFAM和RNA聚合酶POLRMT在相同启动子区域的占据显著减少，表明6mA修饰通过空间位阻或构象改变物理性地阻碍了转录起始复合物的组装。

后续的机制探索证实，甲基转移酶METTL4可直接结合于mtDNA启动子区域，而其催化产生的高水平6mA修饰则会物理性地阻碍转录起始复合物（包括TFAM和POLRMT）在该区域的正常组装，从而直接抑制转录的启动。通过制备一种携带小鼠METTL4基因突变型Ad-METTL4（D286A/W289A）的腺病毒载体：该突变体虽能正常结合mtDNA启动子，但因无法催化生成6mA，故完全丧失了抑制转录复合物组装及下游基因表达的能力。这些结果表明了METTL4是通过其酶活性催化mtDNA启动子区产生6mA修饰，进而特异性抑制转录起始复合物的组装，最终导致线粒体基因组转录停滞和功能衰竭。这一精确机制的解析为后续靶向干预提供了理论基础。

上游调控通路：转录因子p53直接调控METTL4的应激性表达

研究进一步揭示了阐明了心力衰竭应激下调控METTL4表达的上游分子通路，揭示了转录因子p53可直接结合于METTL4基因启动子并驱动其转录。通守的p53反应元件。染色质免疫共沉淀实验（ChIP）证实p53能够直接结合于此位点，且在p53过表达时结合增强。双荧光素酶报告基因实验进一步证明，p53以剂量依赖方式激活Mettl4启动子转录，而缺失p53结合元件的启动子则完全丧失响应能力。在成年小鼠心肌细胞中，AngII/PE应激刺激增强p53与METTL4启动子的结合，并诱导METTL4表达上调，此过程可被p53抑制剂Pifithrin-α完全阻断。另外，p53基因敲除小鼠的心肌细胞在AngII/PE刺激下完全丧失诱导METTL4表达的能力。反之，使用p53激动剂Nutlin-3a直接激活p53通路，足以模拟心力衰竭应激，引起METTL4表达上调和mtDNA 6mA水平升高。这些发现完整揭示了在心力衰竭背景下，p53作为关键应激传感器直接转录激活Mettl4基因，从而启动后续线粒体表观遗传重编程的分子路径，确立了一个从细胞核到线粒体的跨细胞器调控轴。

治疗潜力验证：干预METTL4可预防并治疗心力衰竭

基因敲除的预防效应：构建了心肌细胞特异性METTL4基因敲除小鼠模型发现在压力负荷诱导下，基因缺失能够完全阻止mtDNA 6mA修饰的异常升高，显著保护线粒体呼吸功能与电子传递链复合物活性，有效延缓心力衰竭进程。

基因沉默的治疗效应：在已确立心力衰竭的小鼠模型中，通过AAV9载体递送靶向METTL4的shRNA，能够有效逆转心脏收缩功能障碍、病理性重构及线粒体缺陷。此治疗效果在非缺血性与缺血性心力衰竭模型，以及在雄性和雌性小鼠中均得到证实，凸显了其广谱适用性且强大的治疗潜力。

• 5fC被证实为合子基因重编程中RNA Pol III的的一种激活型表观遗传标记（Parasyraki E, Mallick M, Hatch V, et al. ；Cell）

2024年10月17日发表于 Cell 的研究“5-Formylcytosine is an activating epigenetic mark for RNA Pol III during zygotic reprogramming”揭示了DNA主动去甲基化中间产物5fC在胚胎早期发育中的关键指令性功能。该研究发现，在斑马鱼和小鼠胚胎合子基因组激活时期，细胞核内会短暂形成一个富含5fC的染色中心，该结构被鉴定为与RNA聚合酶III转录相关的核仁周围区。在斑马鱼胚胎中，5fC特异性地高度富集于在ZGA时期被激活的Pol III靶基因上，尤其是卵母细胞型的串联排列tRNA基因。通过操纵Tet和Tdg酶，研究证明5fC作为一种调控性标记，对于招募Pol III以及促进tRNA的表达是必需的。相应地，在体内对tRNA转基因进行5fC修饰能增强其表达。这些结果确立了5fC在合子重编程过程中作为激活Pol III基因表达的表观遗传标记的重要生理角色。

5caC DNA羧基胞嘧啶测序 5-羧基胞嘧啶（5caC）是一种DNA修饰，是DNA去甲基化过程中的关键中间产物之一。在这一过程中5-甲基胞嘧啶（5mC）首先被TET蛋白氧化成5-羟甲基胞嘧啶（5hmC），然后进一步氧化生成5-甲酰基胞嘧啶（5fC）和5-羧基胞嘧啶（5caC）。DNA甲基化和去甲基化的动态平衡对于基因表达的调控至关重要。5caC作为平衡中的一环，参与调节基因的表达和沉默，影响生物体的发育和功能。云序生物提供5caC DNA羧基胞嘧啶测序（5caC DIP-Seq）服务，通过将DNA免疫共沉淀技术与高通量测序技术相结合，能够帮助客户快速且系统的获取全基因组范围内的5caC修饰图谱。

• 5mC/5hmC/5fC/5caC DIP-Seq揭示胚胎干细胞中5fC与5caC的积累依赖于TET-TDG平衡

“Genome-wide analysis reveals TET- and TDG-dependent 5-methylcytosine oxidation dynamics”这篇Cell. Author manuscript通过全基因组分析，揭示了哺乳动物细胞中TET和TDG依赖的5mC迭代氧化动力学。研究利用修饰特异性抗体，在野生型和Tdg缺陷型小鼠胚胎干细胞中绘制了5hmC、5fC和5caC的全基因组分布图谱。结果显示，在野生型胚胎干细胞中，5fC和5caC仅能在主要卫星重复序列区域积累至可检测水平，而在非重复序列位点则难以检测。与之形成鲜明对比的是，敲除Tdg会导致5fC和5caC在大量近端和远端基因调控元件处显著积累。这些发现首次在基因组层面提供了迭代式5mC氧化的动态视图，并证明TET/TDG依赖的主动去甲基化过程在哺乳动物基因组中广泛存在。

云序客户DNA修饰测序文章列表

丰富的产品线为科研团队提供了精准有效的技术支持，助力客户在6mA、5mC、5hmC修饰领域产出多篇高质量研究成果，我们精选代表性客户研究，重点解析其中的核心发现与学术价值，为领域内研究提供参考。

2024年11月6日云序客户在 MedComm发表了一项研究“Tet Methylcytosine Dioxygenase 3 Promotes Cardiovascular Senescence by DNA 5‐Hydroxymethylcytosine‐Mediated Sp1 Transcription Factor Expression”揭示了TET3是驱动心血管细胞衰老的关键表观遗传调控因子。该研究发现在衰老的内皮细胞和衰老小鼠心血管系统中，TET3的表达和其催化的DNA 5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）水平均显著升高。机制上，TET3通过提升SP1转录因子基因上的5-hmC修饰来上调SP1表达，进而SP1与ETS1协同作用，共同增强p53的表达，最终推动细胞衰老进程。此外，研究还发现p53能够反过来正反馈增强TET3和5-hmC水平，形成一个促进衰老的放大环路。这些发现阐明了TET3/5-hmC/SP1/p53信号轴在心血管衰老中的核心作用。

在Frontiers in Genetics发表的“Abnormal transcriptome-wide DNA demethylation induced by folate deficiency causes neural tube defects”这项揭示叶酸缺乏导致神经管缺陷新机制的研究中，5mC MeDIP-seq与5hmC MeDIP-seq结合qPCR验证的技术组合发挥了核心作用。研究人员利用这些关键技术精准绘制了叶酸缺乏下小鼠胚胎干细胞的全基因组DNA甲基化图谱，首次发现胚胎出现了异常的转录组范围DNA去甲基化，具体表现为转录起始位点（TSS）的5hmC修饰增多而5mC减少。这种由去甲基化酶Tet1驱动的表观遗传重编程，进一步通过招募增强子标记H3K27ac至Shh通路基因，从而异常激活了Shh信号通路。该机制在母体低叶酸水平的胎鼠模型中得到证实，qPCR分析同样检测到Shh靶基因及Tet1的上调。综上所述，本研究通过5mC/5hmC MeDIP-seq+qPCR这一强有力的技术路径，阐明了叶酸缺乏通过促进Tet1介导的DNA去甲基化，进而异常激活Shh通路最终导致神经管闭合异常的深层分子机制，为理解叶酸预防出生缺陷的生物学过程提供了坚实的表观遗传学证据。

2022年8月25日发表于 The Plant Journal 的研究“DNA and coding/non-coding RNA methylation analysis provide insights into tomato fruit ripening”通过多组学联合分析，深入探究了表观遗传调控在番茄果实成熟中的作用。该研究利用5mC MeDIP-seq和m5C MeRIP-seq等技术，系统描绘了番茄果实成熟过程中的DNA甲基化（5mC）和RNA甲基化（m5C）图谱。研究发现，在正常果实中，多个与胁迫响应（如STPK、WRKY40）和细胞壁代谢（如PG、EXP-B1）相关的mRNA其m5C水平随成熟而增加。在Nr突变体中，也鉴定出与成熟相关的m5C修饰mRNA。研究还发现，5mC甲基化变化与基因表达差异存在关联，许多差异表达基因的差异甲基化区域编码了与乙烯生物合成和信号转导（如ACO5, ACS7, EIN3, EBF1）相关的关键转录因子和酶。这些发现共同揭示了DNA和RNA甲基化在精确调控番茄果实成熟网络中的关键作用，为理解果实发育和改善采后特性提供了新的表观遗传学见解。

2023年3月15日发表于 Heliyon 的研究“Genome-wide methylation analysis of circulating tumor DNA: A new biomarker for recurrent glioblastoma”为复发性胶质母细胞瘤（GBM）的生物标志物开发提供了新思路。该研究通过ctDNA甲基化测序技术，对复发性GBM患者的脑脊液（CSF）循环肿瘤DNA进行了全基因组甲基化图谱分析，并与肿瘤组织的转录组谱进行关联。通过结合中国脑胶质瘤基因组图谱（CGGA）和GEO数据库的数据，研究人员对差异甲基化区域和差异表达基因进行了Lasso回归和多因素Cox分析，最终筛选出8个核心基因。基于这8个基因构建的诊断模型（AUC = 0.944）和预后预测模型（3年生存期，AUC = 0.876）均表现出极高的准确性。这项研究成功鉴定出一组可用于复发性GBM诊断和预后评估的新型生物标志物，为该疾病的临床管理提供了有力的工具。

无论是高分突破还是特色探索，这些研究成果的背后，都离不开精准、高效的DNA修饰检测技术支撑。我们的核心技术优势体现在：

1. 一站式服务：

客户只需要提供细胞、组织或者样本的基因组DNA，云序生物为您完成从修饰DNA片段富集、文库构建、上机测序、数据分析等整套服务流程。

2. 修饰类型覆盖：

可实现5mC、5hmC、6mA、O8G、5fC、5caC等多种DNA修饰的精准检测，满足不同研究需求。

3. 优化的实验流程：

DNA免疫共沉淀实验的富集效率是决定数据质量的关键，云序生物DIP实验采用特异性强的抗体和精心优化的实验流程，因此具有极高的效率和特异性。

4. 严格的质控：

云序生物对DNA免疫共沉淀的各个关键步骤进行严格的质控，全程监控实验质量，确保客户得到优质的数据。

5. 专业的生物信息学分析：

云序生物具有专业的生物信息学团队，能够满足客户的各类深入数据分析需求。