1. 共转录R-loops：在转录过程中，新生 RNA 会非常短暂地与RNA聚合酶的活性位点内的 DNA 模板结合，形成短暂的R-loop（图1）。共转录的R环主要积累在启动子和转录起始位点以及转录终止位点附近。

图1.共转录R-loop

2. 端粒处的R-loops：含有端粒重复序列的RNA（TERRA，Telomeric repeat-containing RNA）在端粒形成R-loop（图2）。端粒R-loop使TERRA能够与端粒结合并维持端粒，但也会产生基因组不稳定性。因此，对TERRA和端粒R-loop的适当调控可能对端粒的正常功能非常重要。

图2.端粒处的R-loop

3. 中心粒的R-loops：在人类细胞中可以检测到中心粒和中心周卫星 DNA （pericentric satellite DNA）的RNA转录产物。α-卫星重复序列的RNA转录产物与中心粒结合，表明它们以顺式（cis）方式形成R-loop。

4. 复制过程中产生的R-loops：DNA聚合酶-α(Polα)-引物酶复合物在滞后链上的冈崎片段中合成RNA引物，从而形成RNA-DNA杂交体。DNA复制过程中核糖核苷酸(NTP，Ribonucleotide )的错误掺入也会产生RNA-DNA杂交体。当前导链DNA聚合酶异常停滞时，DNA引导的引物酶/聚合酶蛋白 (PrimPol) 在停滞的聚合酶之前重新启动复制，产生 DNA-RNA 杂交结构。

5. DNA损伤的R-loops：DNA双链断裂，RNA聚合酶 II(Pol II)被MRE11-RAD50-NBS1(MRN)复合物招募到DNA双链断裂处，使Pol II能够进行RNA从头合成。Pol II置换的DNA链与复制蛋白A (RPA)结合形成R-loop，以保护新生的DNA链。

6. 线粒体中的R-loops：R-loop也在线粒体DNA（mtDNA）中积累，mtDNA由重链（H链）和轻链（L链）组成。在mtDNA的控制区域可以检测到R-loop，而R-loop中RNA的3'端与ori-H（重链合成起源）重合。

7. 人为基因编辑中的 R-loops：在CRISPR-Cas基因编辑系统中，Cas蛋白与小型引导RNA（gRNA）结合形成复合物，识别并切割目标DNA序列。在识别目标DNA时，gRNA侵入双链DNA并形成R-loop。

1. 物理检测：分离并物理分析对核糖核酸酶（RNase）A具有抗性、对RNase H敏感的核酸。

2. 电子显微镜（EM）观察：通过EM观察R-loop结构。

3. 染色质免疫沉淀（ChIP）和/或免疫荧光（IF）技术：可以通过ChIP和/或IF技术使用失活的RNase H以及与绿色荧光蛋白（GFP）融合的RNase H1杂交结合域（HB）识别R-loop（图3）。

4. S9.6抗体法：目前最常用的方法是依赖于S9.6抗体捕获R-loop（图3）。该抗体能以亚纳摩尔级亲和力识别DNA-RNA杂交体，已被广泛用于DNA-RNA杂交免疫沉淀（DRIP）实验，后续可进行特异性DNA区域的qPCR检测或高通量测序，也可用于IF分析。

图3.R-loop检测方法

 1) DRIP-Seq

DRIP-Seq技术是最早被开发基于S9.6抗体法的R-loop检测技术，用限制性内切酶对基因组进行片段化，然后利用S9.6抗体免疫共沉淀R-loop得到S9.6和R-loop复合物，去除蛋白后，对IP下来的核酸进行文库构建和测序（图4）。DRIP-seq技术可实现对R-loop形成机制的全基因组范围深度解析。

2) DRIPc-Seq

尽管DRIP-Seq技术具有应用价值，但其分辨率有限且无法提供链特异性信息。为突破这些局限，科学家们开发出一种链特异性方法——DNA-RNA免疫沉淀后cDNA转化结合高通量测序（DNA:RNA immunoprecipitation followed by cDNA conversion coupled to high throughput sequencing, DRIPc-Seq），该方法可精准绘制各类细胞群体中的R-loop分布图谱（图4）。简单地说，经过温和的DNA提取和限制性内切酶酶切片段化后，用S9.6抗体对R环结构进行免疫沉淀实验（该抗体对RNA-DNA杂交物显示出亚纳摩尔亲和力，对双链DNA几乎没有亲和力）。杂交体的RNA链通过DNase I处理释放，并用dUTP进行逆转录合成第二条链。随后用尿嘧啶- N -糖基酶（UNG）处理，确保了文库仅由一条链构建。然后在满足质量控制后对cDNA进行扩增和测序。

图4.DRIPc-Seq流程示意图

注：绿色箭头代表DRIP-Seq流程，比DRIPc-Seq简单但分辨率更低。

3) ssDRIP-Seq

基于单链DNA建库的DNA:RNA杂合链免疫共沉淀及高通量测序技术（single-strand DNA ligation-based library construction of DNA:RNA hybrid immunoprecipitation and sequencing, ssDRIP-Seq）的原理与DRIPc-Seq相似。实验开始时，同样采用温和的DNA提取法获取样本，并通过限制性内切酶对其进行片段化。接着，利用S9.6抗体对R-loop进行免疫沉淀。随后，将Adp1连接到ssDNA的3' 端，Adp2连接到ssDNA的5' 端，进而对连接产物进行扩增及测序。在后续的生物信息学分析中，可根据所连接的接头序列来区分不同的DNA链，从而实现对R-loop结构中DNA的精准分析。该方法表现出易操作、精准、高效、高度灵敏、可重复性好等优点，可获得DNA链特异性信息，还避免了基于随机引物的方法产生的固有偏差。

图5.ssDRIP-Seq流程示意图

4) R-loop CUT&Tag

云序生物正式推出R-loop研究新品——R-loop CUT&Tag，该技术基于CUT&Tag体系，利用S9.6抗体在全基因组范围内对R-loop进行定位。当S9.6抗体结合R-loop后，Protein A蛋白可直接结合抗体，携带的Tn5转座酶可特异性地切割目的蛋白附近的DNA片段，并将DNA片段连上接头，文库构建之后可进行高通量测序（图6）。该方法显著简化了传统的DRIP-Seq技术，无需细胞交联、超声、免疫沉淀和接头连接等步骤，具有样本需求量少、省时高效、背景信号低和可重复性好等优点。R-loop CUT&Tag技术的关键在于其能够在高分辨率下进行抗体-DNA复合物的标记和测序，高灵敏度地在全基因组水平检测R-loop，从而为表观遗传学研究提供了重要的工具。

图6.R-loop CUT&Tag流程示意图

标题：Genomic profiling of native R loops with a DNA-RNA hybrid recognition sensor

发表时间：2021/02/17

发表期刊：Science Advances  IF=11.7

研究对象：人类HEK293T细胞

研究方法：R-loop CUT&Tag, EMSA, TT-Seq, caRNA-Seq, PRO-Seq，DRIPc-Seq, qPCR等

文章链接：Genomic profiling of native R loops with a DNA-RNA hybrid recognition sensor

研究概述：R-loop是一种独特的三链结构，参与多种关键生物过程并与人类疾病密切相关。准确全面的R环分析是开展相关研究的基础。该研究通过结合CUT&Tag技术与GST-His6-2×HBD（谷胱甘肽S-转移酶-六组氨酸-2×杂合结合域）——一种特异性识别DNA-RNA杂交体的人工DNA-RNA杂交传感器，建立了基于Tn5转座子的独立R-loop CUT&Tag检测方法。实验证明该方法灵敏度高、重复性好，能以高分辨率对天然R-loop进行精准定位。研究发现，捕获策略而非传感器特异性才是导致不同方法差异的主要原因。该研究为天然R-loop基因组分析提供了独立策略，并有助于解决多种R-loop定位方法间的差异问题。

标题：Global coupling of R-loop dynamics with RNA polymerase II modulates gene expression and early development of Drosophila

发表时间：2024/10/29

发表期刊：Nucleic Acids Research  IF=13.1

研究对象：果蝇

研究方法：R-loop CUT&Tag, RNA-Seq, ChIP-Seq, ATAC-Seq, DRIP-Seq, RT-qPCR, Western blot, Dot blot等

文章链接：Global coupling of R-loop dynamics with RNA polymerase II modulates gene expression and early development of Drosophila

研究概述：R-loop在细胞中参与多种生物学过程，但其体内调控机制及其对发育的影响仍有待探索。该研究通过R-loop CUT&Tag技术分析果蝇不同发育阶段的R-loop分布。研究发现，RNA聚合酶II（RNAP II）的丰度似乎是R-loop形成的普遍诱导因子。研究人员还将R-loop CUT&Tag与ATAC-Seq和RNAP IIChIP-Seq联合分析，发现3/4的R-loop位于染色质开放区域。总而言之，该研究揭示了动态R-loop调控由RNAPII暂停和转录活性共同决定，并在基因调控、基因组稳定性维持及果蝇发育中发挥反馈作用。

标题：Genome-wide mapping of G-quadruplex structures with CUT&Tag

发表时间：2021/11/18

发表期刊：Nucleic Acids Research  IF=13.1

研究对象：小鼠胚胎干细胞

研究方法：R-loop CUT&Tag, G4 CUT&Tag, G4 ChIP-Seq等

文章链接：Genome-wide mapping of G-quadruplex structures with CUT&Tag

研究概述：单链基因组DNA能够折叠形成G-四链体（G4）结构或生成R环。最新研究表明，这类非典型DNA结构会影响基因表达、DNA甲基化、复制叉移动及基因组稳定性。该研究采用G4 CUT&Tag技术在哺乳动物细胞系中实现了高分辨率、低背景干扰的天然G4结构定位。研究揭示，G4基序与结构的存在可区分小鼠ESC中的活性增强子与预激活增强子。通过R-loop CUT&Tag实验，该研究证实单链DNA、G4结构与R环在启动子和增强子区域呈现全基因组共定位。