• 多重荧光免疫组化（mIHC）—单细胞/空间转录组下游验证

     

     

    技术简介：

    单细胞转录组和空间转录组等高通量测序技术的迅猛发展，使得研究者能够在单细胞精度和空间原位层面获得海量的分子表达图谱，极大地推动了肿瘤微环境异质性、细胞发育谱系及免疫治疗响应机制等研究。然而，这些技术带来的往往是“发现”层面的候选靶标或细胞亚群，其产生的高维数据亟需在组织原位进行验证与功能定位；面对如何将海量测序数据有效转化为临床病理证据、进而推动临床转化这一核心挑战，多重荧光免疫组化（mIHC）技术凭借其在组织原位的多重蛋白检测能力，成为连接多组学发现与临床诊断之间不可或缺的桥梁。

    多重荧光免疫组化（mIHC）是一种基于酪胺信号放大（TSA）系统的组织原位蛋白检测技术，能够在同一张FFPE组织切片上实现多靶标的同时检测。该技术基于酪胺酸信号放大（Tyramide dignalamplification, TSA）系统，利用辣根过氧化酶（HRP）对靶蛋白或核酸进行高密度原位标记，实现酶促信号级联放大。一张切片可呈现1-8个靶标蛋白标记，结合DAPI可达到9色检测，既高效节约珍稀样本，又能全面获取细胞表型与空间分布信息。

    在实验流程层面，mIHC不仅兼容常规的临床病理FFPE样本、活检穿刺样本及组织芯片，而且对抗体来源不设限制（鼠兔来源均可，无需考虑种属交叉反应），极大降低了实验设计门槛。每轮标记循环包含一抗孵育、HRP二抗结合、TSA荧光反应和微波热修复四个步骤，重复该循环直至所有靶标标记完成。 基于TSA的mIHC/IF技术

    基本工作原理：

    1)特异性一抗与目标抗原结合后，HRP标记的二抗与一抗结合

    2)加入的酪胺荧光素底物在HRP和过氧化氢作用下被激活

    3)活化的荧光素与组织蛋白中酪氨酸残基发生共价偶联

    4)微波处理洗除非共价结合的抗体，共价结合的荧光素稳定保留

    5)通过多轮标记循环，可在同一组织切片上实现多种靶标的同时标记

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    基于TSA的mIHC/IF技术实验流程示意图

     

    mIHC技术尤其适用于单细胞测序和空间转录组数据的下游验证。单细胞测序能够发现新的细胞亚型，但无法提供细胞在原组织中的空间位置信息；空间转录组虽能定位基因表达，但分辨率往往不足以精细识别细胞亚型。mIHC恰好弥补这些缺憾——通过设计多标志物组合，可在组织原位确认特定细胞亚型的存在、定量其密度与浸润程度，并解析不同细胞（如肿瘤细胞与免疫细胞）之间的空间相邻关系。

     

    云序优势

    1.一张切片，多重靶标：

    一张切片可实现1-8个蛋白靶标标记，配合核染达到9色成像，高效节约珍稀样本，精准获取细胞表型与空间分布信息。

    2.结果可直接作为临床报告使用：

    多重荧光染色二抗试剂盒及全自动免疫组化染色机等全线产品已获医疗器械认证。染色图像和定量分析结果可直接作为临床报告依据，满足从科研探索到临床检测的无缝衔接，为伴随诊断开发和新药临床试验病人筛选提供合规化工具。

    3.抗体选择零限制：

    由于每轮仅使用单一抗体孵育，完全无需考虑多抗间的交叉反应及一抗二抗的种属匹配问题，所有靶标均可使用同一来源（鼠/兔）抗体，实验设计极为简便。

    4.全自动流程+智能分析：

    支持全片全景扫描，图像永久保存；通量可达80片/批次，人工结合软件算法可实现批量操作。多光谱成像系统配备一键扣除组织自发荧光功能，光谱高精度拆分确保各通道信号无串色干扰。图片呈现色彩丰富，靶标颜色可自由更改，便于学术发表和临床报告的多形式呈现。

     

    相关产品：

    1.空间转录组FFPE解决方案

    2.空间转录组OCT解决方案

    3.单细胞转录组测序技术

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

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  • 高分文章案例  

    案例1：mIHC技术验证真菌预测模型揭示的T细胞耗竭特征

    原文：Multi-kingdom gut microbiota analyses define bacterial-fungal interplay and microbial markers of pan-cancer immunotherapy across cohorts

    发表时间：2023/11/08

    发表期刊：Cell Host & Microbe

    影响因子：23.2

    发表单位：上海交通大学医学院

    该研究通过多队列宏基因组分析构建了真菌标志物预测模型，用于预测免疫检查点抑制剂疗效。为验证模型可靠性，研究团队利用多重荧光免疫组化（mIHC）技术对30例非小细胞肺癌患者肿瘤组织进行染色验证。结果显示，模型预测的响应者中耗竭相关标志物（PD-1、PD-L1、CTLA-4和TIM-3）表达率显著高于无反应者，与转录组分析结果一致。该研究充分体现了mIHC在单细胞/空间组学下游验证中的核心价值——在组织原位实现多靶标同时检测、精准定量蛋白表达水平，为新型生物标志物挖掘提供了合规化的组织学验证工具。

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    案例2：mIHC技术验证肿瘤角化相关SPRR3细胞与免疫浸润的空间关联

    原文：A tumor cornification and immune-infiltration-based scheme for anti-PD-1 plus chemotherapy response in advanced squamous cell lung carcinoma

    发表时间：2025/02/14

    发表期刊：Cell Press Med

    影响因子：11.8

    发表单位：上海同济大学

    通过ORIENT-12队列的RNA-seq数据，研究者发现肿瘤角化水平显著影响鳞状细胞肺癌的肿瘤微环境，并据此建立了LICC疗效评估方案。研究进一步揭示角化信号主要来源于SPRR3阳性肿瘤细胞，其可能通过CD24-SIGLEC10轴（M2巨噬细胞）维持瘤内免疫抑制微环境。为验证SPRR3细胞亚群与免疫细胞浸润的关系，研究团队首先通过流式细胞术在53例新鲜手术样本中证实了SPRR3肿瘤细胞与CD8+T细胞呈显著负相关、与CD56bright NK细胞呈正相关。在此基础上，多重荧光免疫组化（mIHC）技术被用于74例FFPE样本的原位验证，mIHC染色清晰表征了SPRR3细胞与CD8+T细胞、NK细胞及巨噬细胞在组织中的空间分布关系，定量分析确认SPRR3细胞占比与CD8+T细胞（r=-0.24，p=0.0371）及GZMB+CD8+T细胞均呈显著负相关，与CD56bright NK细胞呈正相关。该研究表明mIHC能够在组织原位对多组学发现进行大样本验证，精准量化特定细胞亚群的空间分布与相互关系，是将测序数据分析结论转化为组织学证据的关键技术手段。

     

     

  • 数据分析（仅供展示  详见demo报告）

    一、基础分析内容：

    1. 组织区域识别与拆分

    识别并拆分特定的组织区域（如肿瘤区、间质区等），输出各区域的面积占比、区域数量等定量数据。

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    2. 细胞识别与拆分

    基于DAPI核染识别出每一个独立细胞，输出细胞总数的统计数据。通过识别每个视野中的细胞核，确保真实细胞被准确计数，排除碎片或非特异性信号干扰。

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    3. 细胞类型分型

    由用户预先定义多种细胞类型（如CD8+T细胞、肿瘤细胞、巨噬细胞等），软件通过自主学习将每个单细胞自动归入对应类型，输出不同类型细胞数量的统计数据。

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    4. 多靶标荧光成像图

    输出不同视野下多靶标merge融合图及各靶标单通道拆分图像。

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    5. 指定双阳性共表达结果图

    根据用户指定的双靶标组合，输出同一视野下双阳共表达的结果图像（如CD4+FoxP3+双阳性细胞）。

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    6. 基础数据结果

    6.1 分析在不同视野下，肿瘤区和间质区中单阳或者双阳靶标表达的细胞数目统计

    6.2 分析在不同视野下，肿瘤区和间质区中单阳或者双阳靶标表达的细胞占

    6.3 分析在不同视野下，肿瘤区和间质区中单阳或者双阳靶标表达的细胞密度

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    二、高级分析结果

    1. 细胞表型数目统计柱状图

    根据用户需求提供细胞单阳/双阳/三阳及以上表型的细胞数目柱状图。横轴为样本视野，纵轴为细胞数目，可分不同区域/视野进行展示。

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    2. 细胞密度统计柱状图

    根据用户需求提供细胞单阳/双阳/三阳及以上表型的细胞密度柱状图。横轴为样本视野，纵轴为细胞密度，可分不同区域/视野进行展示。

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    3. 最邻近分析

    识别某一细胞或对象最邻近的其他细胞/对象的数量及平均距离、中位距离。基于中位距离结果生成热图，直观展示不同细胞类型间的空间邻近关系。

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    4. 邻近度分析

    在用户定义的半径范围内，基于某一细胞群量化另一细胞群的细胞数量，对不同细胞/对象的邻近距离关系进行分析，输出可定制的直方图。

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    3.聚类分析

    依据基因表达相似性进行空间聚类，精准划分组织功能区域和细胞群。

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    4.个性化分析

     

     

     

     

  • 样品要求

    样品类型：

    蜡块、石蜡切片、病理切片、新鲜组织样本；

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    抗体要求：

    一抗需验证可用于IHC实验，优先选择特异性强的单克隆抗体（多抗易产生非特异性背景），优先推荐兔子或小鼠来源（但技术本身不限种属）。客户需提供一抗（或由云序代买）。

     

    样品运输与保存：

    1.组织固定：离体样本应在30分钟内使用10%中性缓冲福尔马林固定12-48h，以减少热缺血导致的RNA降解。建议组织块大小不超过10mm x 10mm x 5mm，厚度建议在3-5mm之间。太厚的样本会导致固定液渗透缓慢，中心组织腐败降解；太薄则不利于后续切片；

    2.要求组织脱水充分、浸蜡充分；蜡块保存完整，组织原有结构保持完好，无组织风干、发霉或被腐蚀等异常情况；

    3.蜡块可正常进行切片，无裂痕、无人为空腔、且贴片后不会发生蜡与组织分离、脱片。

    4.优先选择6个月内的蜡块。存档超过6个月的样本需预先提供RNA质量检测。（DV200 > 50%：优秀，极佳的实验成功率；30% < DV200 < 50%：中等，可进行实验，建议增加测序深度；DV200 < 30%：风险极高，不建议进行空间转录组实验）

    5.FFPE样本保存：建议储存在冷室(4°C)的干燥皿中。虽然蜡块在室温下稳定，但长期室温存放会引起蜡块氧化和缓慢的RNA降解

    6.FFPE样本运输：

    1)石蜡块：单独包裹后放入硬质收纳盒，填充空隙固定，自封袋密封并放置干燥剂，建议抽真空保存。

    2)玻片：HE玻片与空白切片分开放置于硬质玻片盒内，填充固定并使用封口膜密封防潮。

    3)运输：使用泡沫保温箱配合1–2个预冷冰袋运输，禁止使用干冰，避免石蜡块低温脆裂。

技术服务

Technical Service

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