单碱基D修饰测序（CRACI-Seq）技术

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技术简介：

二氢尿苷（Dihydrouridine, D）是RNA分子中最古老且含量最丰富的化学修饰之一，广泛存在于细菌、真核生物及部分古菌的转运RNA（tRNA）中。D由尿嘧啶核苷的C5–C6双键经还原饱和而形成，使其嘧啶环失去芳香性，呈现出完全饱和的环状结构。这一独特结构显著影响RNA分子的碱基堆积、碱基配对及局部构象柔性，进而调控RNA的折叠与功能。在tRNA中，D主要集中于D-loop，是仅次于假尿苷（Ψ）的第二大修饰核苷。

近年来，D修饰的生物学功能逐步被揭示。研究发现，D由一类依赖于FMN和NAD(P)H的二氢尿苷合成酶（DUS）催化安装。在哺乳动物中，已鉴定出DUS1L、DUS2L、DUS3L及DUS4L四个同源酶。D修饰不仅参与tRNA结构和稳定性的调控，还影响蛋白质翻译效率。DUS3L敲除细胞翻译速率下降，增殖受损；DUS2L过表达与非小细胞肺癌发生相关；DUS1L则在结直肠癌转移中发挥作用。此外，新近研究表明mRNA上也存在低丰度的D修饰，但其分布和功能尚不明确。

尽管D修饰的重要生理病理意义日益凸显，其系统研究长期受限于检测方法的灵敏度与定量能力。现有技术如AlkAniline-Seq、Rho-seq和D-seq主要依赖逆转录酶在D位点的终止信号，导致以下问题：

灵敏度受到限制，难以检测mRNA等长链RNA中的低丰度D位点；

无法精确定量修饰化学计量比；

无法解析密集修饰区域（如tRNA D-loop中多个D相邻的情况），因为RT终止会阻断后续位点的读取。

因此，迫切需要一种能够单碱基分辨率定量检测D修饰的新技术。

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云序生物CRACI：高通量检测D修饰的关键技术

云序生物提供的单碱基D修饰测序（Chemical Reduction Assisted Cytosine Incorporation sequencing，CRACI）利用强还原剂硼氢化钾（KBH4）将D进一步还原为四氢尿苷，而HIV逆转录酶可高效读通还原后的D位点并优先掺入C，从而将D修饰信号转化为显著的T→C突变特征，并使用可量化的错配率作为修饰率。

以tRNA为例，其核心流程包括：

1.RNA样品制备：从细胞或组织中提取总RNA，分离<200 nt的小RNA

2.末端修复与接头连接：使用T4多聚核苷酸激酶（PNK）修复RNA的3'端并磷酸化5'端，依次连接3'端和5'端接头。

3.化学还原处理：取连接产物，分出等份的input1（常规测序对照）和input2（高dGTP背景下的无处理对照），作为未经还原的对照。剩余RNA加入KBH4，将D完全还原为四氢尿苷。

4.逆转录与突变引入：使用HIV逆转录酶在dGTP/dNTP=1 mM/100 μM的反应体系中进行逆转录。该条件促使逆转录酶在四氢尿苷（还原D）位点处高效读通并产生T→C突变。

5.建库测序与数据分析：对文库进行测序，下机数据经接头修剪、去除低质量reads，与tRNA数据库比对后，提取每个位点的T→C突变率作为D修饰比例。

CRACI实验和分析流程图

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