2-溴丙烯酰胺辅助环化测序（BACS-Seq）技术

技术简介：

假尿嘧啶（Pseudouridine, Ψ）是细胞中最常见的RNA修饰，被称为“第五种核苷酸”，广泛存在于rRNA、tRNA、snRNA以及mRNA中。近年来的系统性图谱研究进一步证实，Ψ在真核与原核生物中均高度保守，并在转录后调控网络中发挥核心作用。

在各类RNA中，tRNA是Ψ富集最显著且功能研究最为深入的分子类型之一。Ψ在tRNA中主要分布于结构稳定区域及反密码子茎环等关键功能结构域，其通过增强局部构象稳定性、优化碱基堆叠以及提升反密码子与密码子的识别精度，从而显著提高翻译保真性与效率。此外，Ψ还参与维持tRNA整体折叠稳定性与抗应激能力，是保障蛋白质翻译质量控制的重要结构基础。

rRNA上的Ψ缺失会干扰翻译精确性及核糖体装配，影响蛋白质合成效率与质量控制体系；在mRNA层面，Ψ不仅参与调控翻译效率与RNA稳定性，还可通过改变碱基堆积与局部结构，影响核糖体解码行为。尤其在终止密码子位点引入Ψ时，可诱导“终止密码子通读”，从而扩展蛋白质翻译产物多样性，这一机制在近年来被重新关注，并与mRNA治疗及疫苗优化密切相关。

近年来围绕Ψ检测的技术方法不断发展，为其在转录组层面的系统解析提供了新的方法学基础。在此背景下，云序生物在Ψ RIP-seq、BID-seq的基础上进一步开发BACS测序方法，实现对RNA中Ψ修饰的单碱基分辨率检测。相较于BID-seq，BACS在修饰捕获效率与信号转化率方面进一步优化，更适用于tRNA、rRNA等高结构复杂度RNA分子的系统性研究。

技术原理

利用Ψ独有的游离 N^6原子，与 2-溴丙烯酰胺发生加成反应，随后通过分子内 O^2-烷基化形成稳定的 nce^1,2Ψ 环化产物；未修饰的尿苷（U）因无游离 N^6，无法发生该反应，实现 Ψ 的特异性标记。nce^1,2Ψ 产物在反转录（RT）过程中碱基配对特性改变，不再与腺嘌呤（A）常规配对，而是被反转录酶识别为胞嘧啶（C），最终在 cDNA 中产生 U-to-C 的特异性突变信号，通过突变率可直接定量Ψ的修饰水平。

实验流程：

RNA样本预处理：提取总RNA，经DNase I去除基因组 DNA后，用镁离子试剂将RNA片段化为约 100–200 bp的短片段，再通过T4多核苷酸激酶修复RNA 3'端，为接头连接做准备。

3'接头连接与纯化：给修复后的RNA连接特异性3'接头，用5'-脱腺苷酶和RecJ核酸酶清除多余游离接头，纯化获得带3'接头的RNA。

2-溴丙烯酰胺反应：将RNA与2-溴丙烯酰胺和磷酸盐缓冲液混合，85℃孵育30min，使Ψ发生环化修饰形成nce^1,2Ψ产物，经两次纯化去除未反应试剂。 cDNA合成与文库构建：利用反转录酶合成cDNA，并纯化得到cDNA，完成接头连接后，进行PCR扩增，以获得足够量的测序模板，并纯化去除反应体系中的引物二聚体及酶等杂质。

测序与比对：通过高通量测序和生物信息学分析，使用专门设计的算法，准确地识别cDNA序列中超出背景噪声的突变位点，从而精确绘制假尿嘧啶修饰图谱。

BACS测序流程图

相关产品：

 1.Ψ-RIP-seq

用于全面检测多种RNA分子上的假尿嘧啶（Ψ）修饰水平。该服务基于特异性抗体富集策略：使用Ψ抗体捕获带有修饰的RNA片段，结合高通量测序，并辅以Input对照样本去除背景干扰。最终通过对比IP与Input样本的序列信息，实现Ψ修饰区域的转录组定位及修饰程度的精准评估。

2.BID-seq

用于假尿嘧啶修饰的高通量检测与单碱基分辨率定位。该技术利用BS诱导反应，将Ψ位点特异性转化为“Ψ-BS加合物”，进而导致逆转录过程中该位点产生明确的碱基缺失信号。通过建库测序与专用数据分析流程，BID-seq可实现对Ψ修饰的精准定量与单碱基定位。