高分文章案例

 

案例一：基于rPRO-Seq的新生RNA分析技术增强转录组图谱解析

原文：Enhancing transcriptome mapping with rapid PROseq profiling of nascent RNA

发表时间：2025/8/7

发表期刊：Molecular Cell

影响因子：16.6

发表单位：迈阿密大学

PRO‑Seq是一项可在单核苷酸分辨率水平绘制转录组图谱，并在启动子与增强子区域同时检测新生转录本的技术。现有PRO‑seq实验流程耗时较长、技术难度较高，且需要大量起始样本。为克服上述局限，该研究建立了快速精准核转录延伸测序（rPRO‑Seq）方法，可在单日内高效完成转录组图谱绘制，提升连接效率、消除接头二聚体，并降低样本损失与RNA降解。rPRO‑Seq所需样本量少，适用于小鼠造血祖细胞（mHPCs）与小鼠神经元。该研究通过在神经元细胞中敲低INTS11，明确了INTS11作为神经发育障碍相关基因调控因子的关键作用。综上，rPRO‑seq是新生转录本分析领域的重要技术突破，可为低样本量下构建患者特异性全基因组转录图谱提供有力工具。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

图1. rPRO‑seq解析mHPC的转录图谱

 

 

案例二：PRO-seq表明巨噬细胞通过RNA聚合酶Ⅱ暂停/释放机制实现连续胞葬作用

原文：Rapid unleashing of macrophage efferocytic capacity via transcriptional pause release

发表时间：2024/3/13

发表期刊：Nature

影响因子：48.5

发表单位：美国华盛顿大学医学院

在发育、炎症或组织损伤过程中，巨噬细胞可通过胞葬作用连续吞噬并处理多个凋亡小体以维持组织稳态。目前尚不完全清楚巨噬细胞如何快速调整其转录程序以实现持续的小体摄取。转录暂停/释放是一种进化保守的机制：RNA聚合酶Ⅱ启动转录20-60个核苷酸后暂停数分钟至数小时，随后被释放以合成完整mRNA。本研究发现，巨噬细胞在接触凋亡小体几分钟内即利用转录暂停/释放机制启动快速转录响应。对于人类和小鼠巨噬细胞而言，无论体内外实验均证明RNA聚合酶Ⅱ的暂停/释放是持续胞葬作用所必需的。值得注意的是，阻断Pol Ⅱ暂停/释放并不会影响Fc受体介导的吞噬作用、酵母摄取或细菌吞噬作用。

通过整合不同时间点的巨噬细胞的三套基因组数据——PRO-seq、RNA-seq和ATAC-seq，研究发现Pol Ⅱ暂停/释放调控着特定转录因子及其下游靶基因的表达。对转录因子EGR3进行机制研究，揭示了EGR3相关重编程涉及细胞骨架和小体处理的其他巨噬细胞基因。利用溶酶体探针和新型遗传荧光报告系统，研究证实暂停/释放机制在胞葬过程中参与吞噬体酸化调控。此外，egr3缺陷斑马鱼胚胎的小胶质细胞显示对凋亡神经元的吞噬减少，且成熟吞噬体数量下降，表明其小体处理能力存在缺陷。这些数据共同表明，巨噬细胞通过RNA聚合酶Ⅱ暂停/释放机制快速改变转录程序，从而有效处理摄入的凋亡小体并实现连续胞葬作用。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

图2. 转录暂停/释放有助于胞吞作用

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

案例二：通过PRO-seq揭示m6A修饰能保护新生RNA并促进高效转录

原文：Dynamic control of chromatin-associated m6A methylation regulates nascent RNA synthesis

发表时间：2022/3/17

发表期刊：Molecular Cell

影响因子：16.6

发表单位：复旦大学生物医学研究院

 

N6-甲基腺苷（m6A）通过共转录沉积在mRNA上，但m6A对转录的可能作用仍知之甚少。该研究证明METTL3/METTL14/WTAP作为m6A甲基转移酶复合物（MTC）定位于许多启动子和增强子区域，并将m6A修饰沉积在新生转录本上，包括pre-mRNA、启动子上游转录本（PROMPT）和增强子RNA。PRO-seq分析表明，在METTL3缺失的细胞中，源自启动子和增强子的新生RNA显着减少。此外，受Integrator复合体调控发生提前转录终止的基因区域中METTL3含量降低，提示METTL3与Integrator复合体可能存在拮抗作用。与此一致的是，研究发现当MTC或核内m6A结合蛋白缺失时，Integrator复合体组分INTS11在启动子和增强子区域的富集水平升高。综上，研究结果表明MTC介导的m6A修饰能保护新生RNA免受Integrator复合体介导的转录终止，从而促进高效转录，揭示了RNA m6A修饰的基因调控方向。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

m6A通过hnRNPG保护新生RNA免受INST11介导的切割

 

 

 

 

 

云序优势

 1.样本需求量低

rPRO-Seq通过优化实验流程与文库构建方案，大幅提升文库构建效率、降低样本损失，起始样本量需求低，适配原代细胞、分选细胞、微量组织等细胞数量有限的样本类型。

2.流程快速，结果稳定

rPRO-Seq在保持PRO-seq单碱基分辨率优势的同时，对实验流程进行了系统性优化。整体实验周期显著缩短，有效降低了操作过程中引入的技术波动，提升了数据的一致性与可重复性。

3.接头优化——提升连接特异性与文库质量

rPRO-Seq采用5′ 端预先腺苷酸化活化的3′ 接头，该接头无需额外ATP参与即可直接与RNA 3′ 末端发生连接反应，避免了非特异性连接副产物的形成，显著提升了连接反应的特异性与效率。

4.引物二聚体显著减少

rPRO-Seq引入二聚体阻断寡核苷酸（DBO），该寡核苷酸可与体系中未参与反应的游离3′ 接头特异性杂交，封闭其连接活性，有效阻断接头二聚体的形成。该策略大幅降低了引物二聚体比例，数据质量高。

5.单碱基分辨率

rPRO-Seq每个测序reads的最后一个碱基都精确对应Pol Ⅱ的位置。这对于研究转录起始位点（TSS）、Pol Ⅱ在启动子近端的精确暂停位点等至关重要。

 

 

数据分析（仅供展示 详见demo报告）

一、分析内容

1.原始数据整理，Q30质控

2.去接头处理和序列统计

3.序列的基因组匹配与数据统计

4.Nascent mRNA识别、定量和注释

5.差异nascent mRNA鉴定和注释

6.差异nascent mRNA GO功能富集分析

7.差异nascent mRNA KEGG通路分析

8.nascent mRNA基因集富集分析（GSEA）

9.Nascent mRNA聚类图（Cluster）

10.Nascent mRNA散点图（Scatter）

11.Nascent mRNA火山图（Volcano）

12.Pol Ⅱ在转录起始位点的分布密度（Metagene）

13.转录暂停基因分析

 

二、部分数据分析结果示例

1.差异nascent mRNA识别与注释

云序生物通过edgeR计算nascent mRNA在不同样品组间的表达倍数变化（FC, Fold Change）和P值。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2.差异nascent mRNA GO功能富集分析

基因本体论（Gene Ontology，GO）计划分成3个部分：分子功能（Molecular Function，MF）、细胞组分（Cell Component，CC）、生物过程（Biological Process，BP）。云序生物对差异nascent mRNA进行GO分析。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3.差异nascent mRNA KEGG通路分析

云序生物利用差异nascent mRNA进行通路分析，以注释并推测这些差异nascent mRNA可能参与的通路。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

4.差异表达nascent mRNA富集分析

基因集富集分析（Gene set enrichment analysis，GSEA）将某一通路或功能的基因集对应到表达矩阵（所有基因按照表达由高到低排列）中进行分析，从而判断基因集与表型之间的关联，找出具有协同差异(concordant differences)的基因集。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

5.nascent mRNA聚类分析

聚类图展示样本和基因的聚类关系及表达丰度。横坐标表示样本聚类，样本间基因表达越相似，聚类越紧密；纵坐标表示基因聚类，基于基因在样本中的表达相似性。颜色深浅反映基因表达水平，红色越深表示上调越显著，蓝色越深表示下调越显著。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

6.nascent mRNA散点图、火山图

散点图根据差异基因倍数变化直观的展示各个分组差异基因分布情况。 火山图用于展示各个分组总体基因分布情况（注：需要各处理样本重复数量三个以上才可以绘制火山图）。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

7.PolⅡ在转录起始位点（TSS）的meta分析

转录起始位点（TSS）位于基因的上游调控区域，通常在基因编码区的5’端，紧邻启动子（Promoter）区域。研究表明，PolⅡ会在TSS下游~20-50bp的位置积累，这种启动子近端的暂停或停滞被认为是基因调节的重要限速靶标。分析PolⅡ在TSS的富集程度，可了解基因转录起始的差异、发现新的转录起始位点、研究转录调控机制。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

8.转录暂停基因分析

为了进一步识别所有Pol Ⅱ在TSS暂停、且具有转录活性的基因，云序生物评估了每个基因在启动子近端区域和基因内的reads密度比，从而量化转录暂停水平，统计转录暂停基因分析结果。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3.差异nascent mRNA KEGG通路分析

云序生物利用差异nascent mRNA进行通路分析，以注释并推测这些差异nascent mRNA可能参与的通路。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

4.差异表达nascent mRNA富集分析

基因集富集分析（Gene set enrichment analysis，GSEA）将某一通路或功能的基因集对应到表达矩阵（所有基因按照表达由高到低排列）中进行分析，从而判断基因集与表型之间的关联，找出具有协同差异(concordant differences)的基因集。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

5.nascent mRNA聚类分析

聚类图展示样本和基因的聚类关系及表达丰度。横坐标表示样本聚类，样本间基因表达越相似，聚类越紧密；纵坐标表示基因聚类，基于基因在样本中的表达相似性。颜色深浅反映基因表达水平，红色越深表示上调越显著，蓝色越深表示下调越显著。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

6.nascent mRNA散点图、火山图

散点图根据差异基因倍数变化直观的展示各个分组差异基因分布情况。 火山图用于展示各个分组总体基因分布情况（注：需要各处理样本重复数量三个以上才可以绘制火山图）。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

7.PolⅡ在转录起始位点（TSS）的meta分析

转录起始位点（TSS）位于基因的上游调控区域，通常在基因编码区的5’端，紧邻启动子（Promoter）区域。研究表明，PolⅡ会在TSS下游~20-50bp的位置积累，这种启动子近端的暂停或停滞被认为是基因调节的重要限速靶标。分析PolⅡ在TSS的富集程度，可了解基因转录起始的差异、发现新的转录起始位点、研究转录调控机制。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

样本要求：

样品类型： 细胞、组织

样品要求：

a)细胞：≥5×10^5（建议送样≥1×10^6；要求细胞活率≥80%，细胞大小均一，细胞团及碎片＜5%）

b)组织：≥100mg（冻存的新鲜组织样本）

样品的运输与保存：

样品运输：样品置于1.5 mL管或冻存管中，封口膜封好，干冰运输。

样品保存：PRO测序需要保持一定的活细胞数量，从而保证细胞核抽提质量，因此在细胞采集时需要程序性降温冻存，具体流程参照云序生物样品采集、保存及运输指南。