cfRNA多修饰测序（LIME-Seq）技术

技术简介：

cfRNA（Cell-free RNA，胞外RNA）是一类存在于细胞外的游离RNA分子。这些分子在正常生理过程或病理条件下被细胞释放到胞外，除了血浆和血清以外，尿液、脑脊液、乳头溢液、玻璃体液等不含细胞结构的体液样品也可以检测到cfRNA。cfRNA已成为各种疾病（包括癌症、多种传染病、心血管疾病和神经系统疾病等）诊断中极有前途的生物标志物，可用于癌症的早期筛查、治疗效果监测和预后评估，为肿瘤的无创诊断提供了新途径。但由于胞外的环境复杂、降解酶丰富，导致cfRNA高度碎片化、异质性高且信噪比低（病灶来源的cfRNA占比低）。如何挖掘这些丰度低、易降解、易污染的分子标志物，是cfRNA研究中的主要挑战。

近期，何川团队在《Nature Biotechnology》（IF=41.7）发表的一项研究表明，与检测肿瘤来源的cfRNA相比，分析肠道微生物cfRNA的RNA修饰模式可在更早阶段识别结直肠癌（CRC），为癌症早筛提供了新视角。该研究采用低起始量多重甲基化测序技术（low-input multiple methylation sequencing，LIME-seq），仅需600μL血浆即可捕获肠道菌群在癌症的压力下释放出的、过度修饰的cfRNA，能够以更高的灵敏度、特异性和准确性检测CRC，提供了一种全新的、更精准的无创癌症早筛思路。

技术优势：

✅ 极低样本需求：仅需600μL血浆或1.5ng cfRNA

✅ 超高灵敏度：结直肠癌检测灵敏度达93%，准确性98%

✅ 多修饰同步检测：可检测m1A、m3C、m1G等多种RNA修饰

✅ 卓越重复性：技术重复性r > 0.96，结果稳定可靠

技术流程

云序生物新品LIME-seq：实现cfRNA多修饰同步检测

基于这一突破性技术，云序生物正式推出cfRNA多修饰测序LIME-seq服务，实现对cfRNA多分子、多修饰类型的同步高效检测。该服务严格优化并标准化了LIME-seq全流程，确保其超高灵敏度与卓越的重复性。该技术利用RNA修饰在逆转录过程中会产生错配的原理，将不同的修饰类型转换为可识别的碱基突变信号，从而实现对不同RNA分子上的修饰进行精准定位和定量。

其核心流程包括：

1.cfRNA抽提：使用迭代优化的cfRNA提取试剂盒，能够有效去除样本中的蛋白质、基因组DNA及其他RNA杂信号，同时最大限度保留痕量且易降解的cfRNA，为后续建库测序奠定基础。

2.末端修复、加接头：使用末端修复酶系统将cfRNA的5和3'末端修复为平末端。随后，在ATP存在下，利用T4 RNA连接酶将测序接头连接至cfRNA 3'端，确保文库片段的结构符合测序仪的要求。

3.HIV逆转录：该步骤是LIME-seq技术的核心创新。在逆转录过程中，不同的RNA修饰（如m1A、m3C等）会引发碱基错配、提前终止或编码跳跃等异常事件。云序生物采用对RNA修饰具有高耐受性的HIV重组逆转录酶，替代传统易被修饰位点阻断的逆转录酶，将这些事件转换为可被后续测序识别的突变信号。

4.cDNA扩增纯化：对连接接头的cDNA文库进行PCR扩增，以获得足够量的测序模板，并纯化去除反应体系中的引物二聚体及酶等杂质。

5.测序与比对：通过高通量测序和生物信息学分析，使用专门设计的算法，准确地识别cDNA序列中超出背景噪声的不同突变位点，从而精确绘制cfRNA的RNA修饰图谱。

 LIME-seq测序流程图

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