R-loop Cut&Tag技术

 R-loop简介

R-loop又称R环，是含有DNA-RNA双链和被置换的DNA单链组成的特殊三链核酸结构。R-loop广泛存在于各种生物的基因组中，包括细菌、酵母、植物和人类等，其形成既取决于DNA序列特征，也受拓扑结构影响。它通常会出现在基因密度高的活跃转录的起始区和高GC区域，在调控基因转录和影响基因组稳定性方面起着重要作用。

在人类和植物中，R-loop在含有CpG岛（CGIs）的启动子区域显著富集。CGIs存在于大约60%的人类基因的启动子中，特点之一是存在GC skew。高GC skew与基因的高表达和R-loop富集相关。同时，R-loop的分布还受到DNA二级结构，例如G4联体（G-quadruplexes，G4s）等因素的影响，可能有助于提升R-loop的稳定性。此外，R-loop还富集于转录-复制碰撞区域。例如，R-loop在DNA损伤部位形成，特别是在DNA双链断裂（DSB）处，通过招募乳腺癌易感蛋白1（BRCA1）促进同源定向修复。目前越来越多的证据发现这种独特的染色质结构在很多关键的生物学过程中发挥重要功能，包括染色质修饰、转录调控、DNA损伤修复以及基因组稳定性等，并与人类疾病相关的基因组不稳定性存在关联。因此，如何精准定位基因组中的R-loop结构成为众多科研人员关注的焦点。

R-loop结构示意图

R-loop可通过顺式（cis）和反式（trans）形成，顺式R-loop是当RNA聚合酶转录时，新生RNA退火至RNAPII后面的DNA模板链上；反式R-loop是由RNA和远处的DNA链杂交形成，例如基于非编码RNA (non-coding RNA，ncRNA)和向导RNA（gRNA）的R-loop。

R-loop形成示意图

R-loop的功能

根据R-loop的作用，可将其大致分为生理性或“调节性”的R-loop和病理性或“非计划性”R-loop。调节性R-loop与基因调节和基因组稳定性相关，通过调节转录活性、复制、重组、着丝粒功能和DNA编辑等来调节基因活性。同时，调节性R-loop还通过促进修复DNA双链断裂（DSB）和短端粒结构来稳定基因组。如果未及时去除不需要的R-loop，则会导致非计划性R-loop的形成。非计划性R-loop是异常基因调控的来源，可导致基因组的不稳定，例如诱导DNA损伤。

R-loop Cut&Tag技术

那么如何知道细胞内DNA哪些位置上存在R-loop结构呢？近年来科学家们一直在开发全基因组水平上的R-loop研究方法，这些方法主要分为两种策略，一种是基于S9.6抗体的免疫沉淀，另一种是基于失活的RNase H1的免疫共沉淀。S9.6抗体可以特异性识别DNA:RNA杂合链，与双链RNA相比，S9.6对相同序列的杂合链表现出超过100倍的亲和力，对双链DNA则没有明显结合。在失活RNase H1策略中，需要外源导入或者体外表达失活的RNase H1，这给实验操作带来了难度，而S9.6抗体策略对操作者更加友好，因此目前主流的R-loop检测策略是基于S9.6抗体的免疫沉淀技术。

基于S9.6抗体的R-loop检测技术

2021年，武汉大学梁凯威教授团队开发了基于Cut&Tag（Cleavage Under Targets and Tagmentation）的R-loop检测技术，分别利用RNase H1上的HBD结构域和S9.6抗体作为R-loop识别因子。基于这一原理，云序生物推出R-loop Cut&Tag服务，基于Cut&Tag体系，利用S9.6抗体在全基因组范围内对R-loop进行定位。

该技术显著简化了传统的DRIP-seq技术，避免了交联、超声、免疫沉淀和接头连接等步骤，具有省时高效、背景信号低和可重复性好等优点，适用于研究者快速高效地获得细胞内R-loop分布位点，丰富基因转录的表观调控机制。不仅如此，R-loop Cut&Tag对细胞数量的需求也大幅减少，使得科研工作者能够使用更少的样本获得更加优质的数据。

技术原理

Cut&Tag是一种用于研究蛋白质-DNA相互作用和染色质结构的技术。到目前为止，Cut&Tag技术已经用在动物、植物、等实验室常用模式生物和细胞系中表现出广谱的适用性。ChiTag是Protein A蛋白与Tn5转座酶的融合蛋白，当S9.6抗体结合R-loop后，Protein A蛋白可直接结合抗体，携带的Tn5转座酶可特异性地切割目的蛋白附近的DNA片段，并将DNA片段连上接头，文库构建之后可进行高通量测序。R-loop Cut&Tag技术的关键在于其能够在高分辨率下进行抗体-DNA复合物的标记和测序，高灵敏度地在全基因组水平检测R-loop，从而为表观遗传学研究提供了重要的工具。

R-loop Cut&Tag流程示意图

不同R-loop检测技术的应用场景

相关产品

DRIPc-Seq/ssDRIP-seq：

DRIPc-Seq在DRIP-Seq基础上，对免疫沉淀的RNA链进行cDNA建库，明确R-loop中RNA来源链及转录方向。ssDRIP-seq则基于单链DNA建库，进一步提升分辨率。三种方法互相验证可解决不同方法（如S9.6抗体与RNase H1）的定位争议，获取更全面的R-loop信息图谱。

G4 Cut&Tag：

DNA G-四链体（G-quadruplexes, G4s）是由富含鸟嘌呤的DNA序列折叠形成的一种三维二级结构。G-loop（G4-R-loop三元结构）检测需同步使用G4抗体和R-loop抗体，分别进行G4 Cut&Tag和R-loop Cut&Tag，通过交集定位协同区域，揭示G4与R-loop在端粒、启动子区的空间互作。

caRNA-Seq：

R-loop是由新生caRNA与DNA结合形成的一种结构，通过R-loop Cut&Tag与caRNA-seq联合分析能够更好地理解R-loop的生成机制、caRNA的调控功能及二者在疾病中的作用等。