• 蛋白修饰质谱技术

     

     

     

    技术简介：

     

    蛋白翻译后修饰（Post-Translational Modifications, PTMs）是指蛋白质在翻译完成后通过酶促反应或化学修饰在氨基酸残基上添加功能基团的过程。PTMs通过改变蛋白质的结构、活性、定位及相互作用，参与调控几乎所有的细胞生理过程。液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术凭借其高灵敏度、高通量和精准定量的优势，已成为解析蛋白修饰的核心工具。

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    高精度质谱会采集酶解后的肽段，如果肽段发生了某种修饰（如磷酸化），由于序列信息和分子量是确定的，磷酸根的分子量也是确定的，在质谱检测过程中就会发现该肽段的分子量刚好增加了一个磷酸根的分子量，从而识别磷酸化修饰蛋白，随后通过二级质谱图进行二次确认。也可以配合对应PTMs的特异性抗体，对发生修饰的肽段进行富集，从而表征特定修饰对蛋白活性、功能的影响，以及在疾病发展中的作用。

     

     

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    案例：肝脏因子ORM2通过抑制脂肪从头生成（DNL）维持肝脏脂质稳态

    原文：Orosomucoid 2 maintains hepatic lipid homeostasis through suppression of de novo lipogenesis

    期刊：Nature Metabolism   影响因子：19.865   

    产品：磷酸化蛋白质组

     

    非酒精性脂肪肝病（NAFLD）由脂质代谢失衡引发，而肝脏细胞因子在调节肝脏脂质稳态中意义重大。本文着重探究肝脏细胞因子ORM2在NAFLD中的作用及机制。 研究发现，在肥胖小鼠模型（db/db、ob/ob、高脂饮食喂养）和NAFLD患者的肝脏及血浆ORM2水平显著降低。

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    在小鼠和NAFLD患者的肝脏和血浆中，ORM2的表达下调 ORM2敲除

    （KO）小鼠在正常饮食下即出现肝脏甘油三酯（TG）和血浆TG升高，高脂饮食或高胆固醇/果糖饮食会进一步加重肝脂肪变性、炎症及纤维化。

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    ORM2 KO小鼠的肝脏表型

    对Ad-ORM2处理的ob/ob小鼠肝脏进行磷酸化蛋白组学分析，发现AMP激活蛋白激酶（AMPK）信号通路显著激活。验证实验表明，ORM2可增强AMPK及其下游靶点乙酰辅酶A羧化酶（ACC）的磷酸化，抑制mTOR信号。

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    差异磷酸化磷酸化分析及AMPK通路的验证

    研究揭示ORM2作为肝因子通过Ca2+-CaMKK2-AMPK轴抑制DNL的新机制，拓展了肝因子调控脂质代谢的认知。

  • 云序优势：

    高覆盖度：实现蛋白修饰全类型覆盖，助力解析蛋白修饰网络

    精准定量：高分辨率质谱结合富集技术，实现对特定修饰的精准定量分析

    多维分析：整合修饰位点鉴定、定量及功能富集分析，揭示生物学意义

     

    数据分析（仅供展示  详见demo报告）

    1.修饰位点分布分析

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    图1 特定修饰位点的数量分布图（例）

     

     

     

    2.组间样本鉴定重复性韦恩图分析

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    图2 所有组间鉴定到的修饰蛋白质Venn图（例）

     

     

     

    3.聚类分析：生物学样品重复情况；不同蛋白在组间的差异修饰聚类分析

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    图3 差异修饰蛋白聚类图（例）

     

     

     

     

    4.差异蛋白质GO富集分析

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    图4 差异修饰蛋白质的GO富集Circos图

     

     

    5.差异修饰蛋白的Pathway富集分析

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    图5 差异修饰蛋白质的pathway富集蝴蝶图

     

     

     

     

     

    6.差异修饰蛋白火山图

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    图6 差异修饰蛋白质的火山图

  • 样本要求：

     

    样品量：

    a) 细胞：≥5×10^7

    b) 组织：≥300mg

    c) 血液：血清/血浆≥1mL，全血≥1mL

     

    1）富含杂质或蛋白含量低的样本，如植物的根茎、木质部、韧皮部组织等：干重≥5g

    2）植物类样本送样量同样适合于蕈类真菌，如蘑菇、木耳：湿重≥1g。

    3）细胞样本如需进行磷酸化位点富集鉴定，细胞数目须达到：1×10^7，约细胞沉淀体积100µl。

    4）由于解冻后血细胞易破裂，细胞内蛋白溶出来会影响分析结果，因此建议不要直接送全血样本。

    5）血液类样本：如果直接送提取蛋白，需先去除高丰度蛋白。

    6）尿液样本：送样前10000rpm离心5min，弃去沉淀。

    7）如果是其他特殊样本，或对样本要求有疑问，请联系我们。

技术服务

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