上海云序生物科技有限公司-微量GRO测序（rGRO-Seq）

微量GRO测序（rGRO-Seq）技术

技术简介

新生RNA简介

新生RNA（nascent RNA）是指在细胞核内，由RNA聚合酶以DNA为模板新合成，且尚未经历后期加工的原始RNA转录本。与成熟的、进入细胞质的mRNA相比，新生RNA具有几个显著特征：

瞬时性与不稳定：许多新生RNA合成后很快就会被加工或降解，寿命很短，这使其成为研究转录活动的关键；

包含内含子：新生RNA保留了基因的完整序列信息，包括成熟mRNA中的外显子与随后通过剪接去除的内含子；

位于细胞核内：“新合成”且未成熟的新生RNA主要存在于细胞核中。

传统的RNA-seq仅能检测稳定状态下的mRNA，无法揭示当下真实的转录活性。而新生RNA直接反映了RNA聚合酶“工作”的速率，是衡量基因转录启动和延伸速度的最直接指标。同时，研究新生RNA还可以捕捉转录早期的“RNA聚合酶暂停”和启动子近端调控机制，从而捕捉转录的动态过程，而不仅仅是转录的最终结果。精准捕获和定位新生RNA的重要性催生了Run-on方法——依赖转录时掺入核苷酸类似物，便于从总RNA中富集新生RNA，揭示RNA瞬时转录活性。

微量GRO测序介绍

GRO-Seq（Global Run-on Sequencing）是一种全基因组转录延伸测序技术，是捕获nascent RNA、定位RNA聚合酶（Pol II）转录活性位点的有效手段。GRO-Seq已成功应用于全基因组转录活性的评估，揭示了转录暂停释放调控、延伸机制、转录终止等转录关键调控过程。针对疾病引发的转录失调现象（如异常激活或延伸缺陷），GRO-Seq可以追踪基因的即时表达动态，帮助我们揭示其病理机制，从而发现新的驱动基因或耐药机制。然而，传统GRO-seq实验流程复杂、样品需求量大，一定程度上限制了其在微量样本中的应用。针对上述局限，云序生物对技术进行全面升级，推出微量GRO测序（rapid Global Run-on sequencing, rGRO-seq）产品，实现更低的样本投入与更高效稳定的建库性能：

✅️微量：起始样本量仅需大于 5×10^5个细胞，大幅降低样本损耗，适用于原代细胞、分选细胞等细胞数量有限的样本类型。

✅️快速：优化后的实验流程显著缩短周期，减少技术波动，提升数据的一致性与可重复性。

✅️接头优化：采用5′端预先腺苷酸化的3′接头，有效降低非特异性连接产物，提高文库构建的准确性。

✅️引物二聚体少：引入二聚体阻断寡核苷酸（DBO），DBO可与体系中游离3′接头杂交，封闭其连接活性，避免后续5′接头连接过程中形成接头二聚体，大幅提升文库构建效率与数据质量。

技术原理

微量GRO测序基于经典核转录延伸（Run-On）技术升级优化，是适配微量样本的新生RNA测序技术。该技术在转录恢复阶段加入5-溴尿苷（BrU），新生RNA链在延伸过程中会特异性掺入BrU，便于后续的分离和识别。该技术主要流程如下：

1.细胞核提取与速冻：提取细胞核并迅速将其冷冻，使转录过程停滞，固定细胞内的转录状态，为后续操作提供稳定的起始样本。

2.转录恢复：加入含有BrU的转录体系，于30℃恢复转录3-5min，使PolⅡ催化的新生RNA链在延伸过程中掺入BrU。

3.RNA提取：将转录体系转移到冰上，加入Trizol提取RNA。

4.新生RNA富集：使用抗体特异性抓取带有BrU标记的新生RNA片段。

5.3′ 接头连接：使用5′ 端已经被腺苷酸化活化的3′接头进行连接反应，该反应无需额外添加ATP，可有效减少RNA自环化、接头自连等非特异性连接产物，提升接头连接效率与文库质量。

6.DBO二聚体封闭：向反应体系中加入二聚体阻断寡核苷酸（DBO），DBO可与体系中游离3′接头杂交，封闭其连接活性，防止后续5′接头连接过程中形成接头二聚体。

7.5′ 接头连接：在RNA与DBO的混合体系中，进行5′接头连接，完成新生RNA的两端接头连接。

8.文库构建与测序：随后进行反转录构建cDNA文库，通过高通量测序技术，获取全基因组范围内的新生RNA序列信息。

微量GRO-Seq实验流程图

相关产品：

1.微量PRO测序：

rPRO-Seq能实现全基因组范围内PolⅡ转录活性的单碱基分辨率定位，精准解析转录关键调控过程，是转录调控研究领域的核心技术；微量PRO测序起始样本量需求低，适配原代细胞、分选细胞等细胞数量有限的样本类型。

2.Slam-Seq：

Slam-Seq能实时监测RNA合成速率和动态变化，研究RNA转录后调控。与GRO-Seq联合，可解析RNA聚合酶转录活性与RNA稳定性关系，精确定位活跃转录区域，揭示RNA转录延伸效率受RNA稳定性调控的机制，探究基因表达动态变化。

3.mRNA-Seq：

mRNA-Seq测定样品中mRNA表达水平。与GRO-seq联合，从转录起始和mRNA输出维度分析基因表达，区分转录起始活跃但mRNA表达低的基因与转录和mRNA表达均活跃的基因，识别基因表达调控关键环节，全面理解基因表达动态调控。

4.RNA修饰测序：

RNA修饰测序用于揭示RNA的修饰状态。GRO-seq与RNA修饰测序联合应用，GRO-seq能检测活跃转录区域，RNA修饰测序可分析该区域RNA的修饰状态，有助于理解RNA修饰对转录活性的调控机制。

GRO-Seq实验流程图
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高分文章案例

案例案例一：GRO-Seq揭示雌激素信号在乳腺癌细胞中快速、广泛且瞬时的转录调控

原文：A rapid, extensive, and transient transcriptional response to estrogen signaling in breast cancer cells

发表时间：2011/5/13

发表期刊：Cell

影响因子：42.5

发表单位：康奈尔大学

雌激素受体（ERα）在乳腺癌的发生发展中通过调控基因表达发挥关键作用。然而，传统方法（如微阵列或RNA-seq）由于主要检测稳态mRNA，难以区分直接转录调控与次级转录效应。此外，以往研究多集中于RNA聚合酶II（Pol II），而对RNA聚合酶I（Pol I）和RNA聚合酶III（Pol III）的雌激素调控机制尚未进行系统探索。该研究首次运用GRO-Seq技术，在ERα阳性的MCF-7乳腺癌细胞中解析了17β-雌二醇（E2）处理后的即时转录动态。通过开发基于隐马尔可夫模型（HMM）的生物信息学方法，实现了全基因组范围内对所有活跃的RNA聚合酶（Pol I、Pol II和Pol III）的精准定位，揭示了E2通过ERα直接调控的转录组特征。该研究借助GRO-Seq技术重塑了对雌激素转录调控的理解，为乳腺癌靶向治疗和表观转录组学研究提供了关键的理论基础与方法学工具。

图1：GRO-Seq数据与微阵列测量的mRNA表达的比较

案例二：通过GRO-seq和pNET-seq技术揭示拟南芥中RNA聚合酶II活性

原文：RNA polymerase II activity revealed by GRO-seq and pNET-seq in Arabidopsis

发表时间：2018/10/29

发表期刊：Nature Plants

影响因子：13.6

发表单位：中国科学院

RNA聚合酶II（Pol II）在基因表达中发挥着至关重要的作用。该研究运用植物天然延伸转录测序技术（pNET-seq）和全局转录延伸测序技术（GRO-seq），对拟南芥全基因组范围内的新生RNAs进行了分析。研究发现，Pol II倾向于在转录起始位点（TSS）下游积累。具体而言，具有未磷酸化羧基末端结构域（CTD）的Pol II主要聚集在TSS下游；与剪接体相关的Pol II其CTD的丝氨酸5位点发生磷酸化（Ser 5P）；而具有丝氨酸2位点磷酸化CTD（Ser 2P）的Pol II则在多聚腺苷酸化位点（PAS）下游250个碱基对范围内呈现显著的峰值。Pol II 在启动子邻近区域及PAS后的暂停现象均会影响转录速率。该研究证明了这两种方法适用于在植物体内研究Pol II的动态变化。

图2：拟南芥中GRO-seq和pNET-seq实验方法示意图


云序优势

1.样本需求量低

微量GRO-Seq通过优化实验流程与文库构建方案，大幅提升文库构建效率、降低样本损失，起始样本量需求低，适配原代细胞、分选细胞、微量组织等细胞数量有限的样本类型。

2.流程快速，结果稳定

rGRO-Seq对实验流程进行了系统性优化。整体实验周期显著缩短，有效降低了操作过程中引入的技术波动，提升了数据的一致性与可重复性。

3.接头优化——提升连接特异性与文库质量

rGRO-Seq采用5′ 端预先腺苷酸化活化的3′ 接头，该接头无需额外ATP参与即可直接与RNA 3′ 末端发生连接反应，避免了非特异性连接副产物的形成，显著提升了连接反应的特异性与效率。

4.引物二聚体显著减少

rGRO-Seq引入二聚体阻断寡核苷酸（DBO），DBO可与体系中未参与反应的游离3′ 接头特异性杂交，封闭其连接活性，有效阻断接头二聚体的形成。该策略大幅降低了引物二聚体比例，数据质量高。

数据分析（仅供展示详见demo报告）

一、分析内容

1.原始数据整理，Q30质控

2.去接头处理和序列统计

3.序列的基因组匹配与数据统计

4.Nascent mRNA识别、定量和注释

5.差异nascent mRNA鉴定和注释

6.差异nascent mRNA GO功能富集分析

7.差异nascent mRNA KEGG通路分析

8.nascent mRNA基因集富集分析（GSEA）

9.Nascent mRNA聚类图（Cluster）

10.Nascent mRNA散点图（Scatter）

11.Nascent mRNA火山图（Volcano）

12.Pol Ⅱ在转录起始位点的分布密度（Metagene）

13.转录暂停基因分析

二、部分数据分析结果示例

1.差异nascent mRNA识别与注释

云序生物通过edgeR计算nascent mRNA在不同样品组间的表达倍数变化（FC, Fold Change）和P值。

2.差异nascent mRNA GO功能富集分析

基因本体论（Gene Ontology，GO）计划分成3个部分：分子功能（Molecular Function，MF）、细胞组分（Cell Component，CC）、生物过程（Biological Process，BP）。云序生物对差异nascent mRNA进行GO分析。

3.差异nascent mRNA KEGG通路分析

云序生物利用差异nascent mRNA进行通路分析，以注释并推测这些差异nascent mRNA可能参与的通路。

4.差异表达nascent mRNA富集分析

基因集富集分析（Gene set enrichment analysis，GSEA）将某一通路或功能的基因集对应到表达矩阵（所有基因按照表达由高到低排列）中进行分析，从而判断基因集与表型之间的关联，找出具有协同差异(concordant differences)的基因集。

5.nascent mRNA聚类分析

聚类图展示样本和基因的聚类关系及表达丰度。横坐标表示样本聚类，样本间基因表达越相似，聚类越紧密；纵坐标表示基因聚类，基于基因在样本中的表达相似性。颜色深浅反映基因表达水平，红色越深表示上调越显著，蓝色越深表示下调越显著。

6.nascent mRNA散点图、火山图

散点图根据差异基因倍数变化直观的展示各个分组差异基因分布情况。

火山图用于展示各个分组总体基因分布情况（注：需要各处理样本重复数量三个以上才可以绘制火山图）。

7.PolⅡ在转录起始位点（TSS）的meta分析

转录起始位点（TSS）位于基因的上游调控区域，通常在基因编码区的5’端，紧邻启动子（Promoter）区域。研究表明，PolⅡ会在TSS下游~20-50bp的位置积累，这种启动子近端的暂停或停滞被认为是基因调节的重要限速靶标。分析PolⅡ在TSS的富集程度，可了解基因转录起始的差异、发现新的转录起始位点、研究转录调控机制。

8.转录暂停基因分析

为了进一步识别所有Pol Ⅱ在TSS暂停、且具有转录活性的基因，云序生物评估了每个基因在启动子近端区域和基因内的reads密度比，从而量化转录暂停水平，统计转录暂停基因分析结果。
样本要求：

样品类型： 细胞、组织

样品要求：

a)细胞：≥5×10^5（建议送样≥1×10^6；要求细胞活率≥80%，细胞大小均一，细胞团及碎片＜5%）

b)组织：≥100mg（冻存的新鲜组织样本）

样品的运输与保存：

样品运输：样品置于1.5 mL管或冻存管中，封口膜封好，干冰运输。

样品保存：GRO测序需要保持一定的活细胞数量，从而保证细胞核抽提质量，因此在细胞采集时需要程序性降温冻存，具体流程参照云序生物样品采集、保存及运输指南。