高分文章案例

 

案例案例一：GRO-Seq揭示雌激素信号在乳腺癌细胞中快速、广泛且瞬时的转录调控

原文：A rapid, extensive, and transient transcriptional response to estrogen signaling in breast cancer cells

发表时间：2011/5/13

发表期刊：Cell

影响因子：42.5

发表单位：康奈尔大学

 

雌激素受体（ERα）在乳腺癌的发生发展中通过调控基因表达发挥关键作用。然而，传统方法（如微阵列或RNA-seq）由于主要检测稳态mRNA，难以区分直接转录调控与次级转录效应。此外，以往研究多集中于RNA聚合酶II（Pol II），而对RNA聚合酶I（Pol I）和RNA聚合酶III（Pol III）的雌激素调控机制尚未进行系统探索。该研究首次运用GRO-Seq技术，在ERα阳性的MCF-7乳腺癌细胞中解析了17β-雌二醇（E2）处理后的即时转录动态。通过开发基于隐马尔可夫模型（HMM）的生物信息学方法，实现了全基因组范围内对所有活跃的RNA聚合酶（Pol I、Pol II和Pol III）的精准定位，揭示了E2通过ERα直接调控的转录组特征。该研究借助GRO-Seq技术重塑了对雌激素转录调控的理解，为乳腺癌靶向治疗和表观转录组学研究提供了关键的理论基础与方法学工具。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

图1：GRO-Seq数据与微阵列测量的mRNA表达的比较

 

 

案例二：通过GRO-seq和pNET-seq技术揭示拟南芥中RNA聚合酶II活性

原文：RNA polymerase II activity revealed by GRO-seq and pNET-seq in Arabidopsis

发表时间：2018/10/29

发表期刊：Nature Plants

影响因子：13.6

发表单位：中国科学院

 

RNA聚合酶II（Pol II）在基因表达中发挥着至关重要的作用。该研究运用植物天然延伸转录测序技术（pNET-seq）和全局转录延伸测序技术（GRO-seq），对拟南芥全基因组范围内的新生RNAs进行了分析。研究发现，Pol II倾向于在转录起始位点（TSS）下游积累。具体而言，具有未磷酸化羧基末端结构域（CTD）的Pol II主要聚集在TSS下游；与剪接体相关的Pol II其CTD的丝氨酸5位点发生磷酸化（Ser 5P）；而具有丝氨酸2位点磷酸化CTD（Ser 2P）的Pol II则在多聚腺苷酸化位点（PAS）下游250个碱基对范围内呈现显著的峰值。Pol II 在启动子邻近区域及PAS后的暂停现象均会影响转录速率。该研究证明了这两种方法适用于在植物体内研究Pol II的动态变化。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

图2：拟南芥中GRO-seq和pNET-seq实验方法示意图

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云序优势

1.无偏好性：

云序生物GRO-Seq技术服务能够无偏好性地在全基因组范围内定位新生转录本，即使是丰度低且本身不稳定的RNA分子也能被有效检出。

2.高灵敏度：

云序生物GRO-Seq具有极高的灵敏度，可全面覆盖启动子和增强子区域的正向与反向新生转录，从而确定非编码基因组区域的转录活性。

3.一站式服务：

客户只需提供细胞、组织，云序生物为您完成从样本处理、富集、文库制备、上机测序到数据分析整套服务流程。

4.严格的质控：

在GRO-Seq实验的各个环节，云序生物实施全方位、全流程的严格质量控制。从样本处理到数据分析，每一步都进行精密监控与严格评估，确保实验数据的可靠性与精准性，保障客户得到优质、可信的研究成果。

5. 专业的生物信息学分析：

云序生物具有专业的生物信息学团队，能够满足客户的各类深入数据分析需求。

 

 

 

数据分析结果（仅供展示  详见demo报告）

 

一、分析内容

1.原始数据整理，Q30质控

2.去接头处理和序列统计

3.序列的基因组匹配与数据统计

4.Nascent mRNA识别、定量和注释

5.差异nascent mRNA鉴定和注释

6.差异nascent mRNA GO功能富集分析

7.差异nascent mRNA KEGG通路分析

8.nascent mRNA基因集富集分析（GSEA）

9.Nascent mRNA聚类图（Cluster）

10.Nascent mRNA散点图（Scatter）

11.Nascent mRNA火山图（Volcano）

12.Pol Ⅱ在转录起始位点的分布密度（Metagene）

13.转录暂停基因分析

 

二、部分数据分析结果示例

1.差异nascent mRNA识别与注释

云序生物通过edgeR计算nascent mRNA在不同样品组间的表达倍数变化（FC, Fold Change）和P值。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2.差异nascent mRNA GO功能富集分析

基因本体论（Gene Ontology，GO）计划分成3个部分：分子功能（Molecular Function，MF）、细胞组分（Cell Component，CC）、生物过程（Biological Process，BP）。云序生物对差异nascent mRNA进行GO分析。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3.差异nascent mRNA KEGG通路分析

云序生物利用差异nascent mRNA进行通路分析，以注释并推测这些差异nascent mRNA可能参与的通路。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

4.差异表达nascent mRNA富集分析

基因集富集分析（Gene set enrichment analysis，GSEA）将某一通路或功能的基因集对应到表达矩阵（所有基因按照表达由高到低排列）中进行分析，从而判断基因集与表型之间的关联，找出具有协同差异(concordant differences)的基因集。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

5.nascent mRNA聚类分析

聚类图展示样本和基因的聚类关系及表达丰度。横坐标表示样本聚类，样本间基因表达越相似，聚类越紧密；纵坐标表示基因聚类，基于基因在样本中的表达相似性。颜色深浅反映基因表达水平，红色越深表示上调越显著，蓝色越深表示下调越显著。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

6.nascent mRNA散点图、火山图

散点图根据差异基因倍数变化直观的展示各个分组差异基因分布情况。 火山图用于展示各个分组总体基因分布情况（注：需要各处理样本重复数量三个以上才可以绘制火山图）。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

7.PolⅡ在转录起始位点（TSS）的meta分析

转录起始位点（TSS）位于基因的上游调控区域，通常在基因编码区的5’端，紧邻启动子（Promoter）区域。研究表明，PolⅡ会在TSS下游~20-50bp的位置积累，这种启动子近端的暂停或停滞被认为是基因调节的重要限速靶标。分析PolⅡ在TSS的富集程度，可了解基因转录起始的差异、发现新的转录起始位点、研究转录调控机制。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

样本要求：

样品类型： 细胞、组织

样品要求：

a)细胞：≥5×10^7（要求细胞活率≥80%，细胞大小均一，细胞团及碎片＜5%）

b)组织：≥200mg（冻存的新鲜组织样本）

样品的运输与保存：

样品运输：样品置于1.5 mL管或冻存管中，封口膜封好，干冰运输。

样品保存：GRO测序需要保持一定的活细胞数量，从而保证细胞核抽提质量，因此在细胞采集时需要程序性降温冻存，具体流程参照云序生物样品采集、保存及运输指南。