上海云序生物科技有限公司-组织细胞环状DNA测序（Circle-Seq）

组织细胞EccDNA测序（Circle-Seq）技术

技术简介：

游离于染色体基因组之外的DNA(extrachromosomal DNA，ecDNA)常常以环状的形式存在，这种形式的DNA被称为环状DNA (extrachromosomal circular DNA，eccDNA）。目前也习惯将巨大的环状DNA(>1Mb)称为ecDNA，而将相对较小的环状DNA称为eccDNA。传统观点认为真核基因组通常形成稳定的线性染色体。但新的研究表明：无论是在正常体细胞还是癌细胞中，都存在大量染色体外环状DNA。2019年，Nature杂志上发表了颠覆性研究成果：在肿瘤中，主要的癌基因转录本是直接来自于环状DNA的，而环状DNA的染色质是高度开放的，环状DNA的癌基因能够大量表达，同时缺乏着丝粒，导致不遵照孟德尔定律进行遗传，这种特性使得环状DNA是驱动肿瘤异质性的重要机制。由此可见，由于其结构和表达的特异性，环状DNA可以影响细胞生命活动，促进肿瘤细胞演进和适应性进化，增加了基因组的可塑性和不稳定性。目前，环状DNA不仅仅可以作为一种新型特异的肿瘤标志物，还在肿瘤发生发展机理研究中发挥着重大的潜在价值。可以预见的是，环状DNA将迅速成为新的科研热点，甚至会对传统遗传学和基因组学带来革命性影响。

环状DNA形成的机理

目前研究表明，环状DNA是从染色体上断裂、环化或者额外复制产生的序列，其剪切加工机理主要有两种可能：（1）通过染色体异位同源重组（intrachromatid ectopic homologous recombination，HR）环化;（2）通过非同源染色体末端连接（nonhomologous end-joining，NHEJ）环化。环状DNA形成是一个复杂的过程，更多环化方式仍有待探索。

环状DNA 形成模型示意图

组织细胞环状DNA测序服务

云序生物提供组织细胞环状DNA测序服务（Circle-seq），首先进行柱纯化去除线性DNA，针对这一关键步骤，云序生物采用A&A Biotechnology的纯化柱（Plasmid Mini AX; A&A Biotechnology）是绝大部分环状DNA高分文章中所使用的纯化柱，被Springer Protocols收录进入《DNA Electrophoresis Methods and Protocols》实验指南手册，是教科书级别的环状 DNA 纯化手段。云序生物是该品牌纯化柱在国内的专属总代理。之后，高效富集和扩增环状DNA，极大地提高了环状DNA的检出率。富集后，通过NGS测序高通量地检测细胞中所有的环状DNA分子，并通过严谨的环状DNA生信流程，实现对环状DNA准确的识别和详细的基因注释。

云序生物组织细胞环状DNA测序流程示意图
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云序用户案例

案例1：晚期高级别浆液性卵巢癌中染色体外环状DNA的全球性特征分析

原文：Global characterization of extrachromosomal circular DNAs in advanced high grade serous ovarian cancer

发表时间：2022/04/13

发表期刊：Cell Death & Disease

影响因子：9.6

发表单位：浙江大学医学院附属妇产科医院

高级别浆液性卵巢癌(HGSOC)是卵巢癌具有侵袭性的亚型，HGSOC患者经常出现转移，导致预后不良。迄今为止，eccDNA已被证明参与癌症基因组重塑，但eccDNA在转移性HGSOC中的作用尚不清楚。为了检测HGSOC配对的原发组织和转移组织(HGSOC-M)中的eccDNA，作者对四对标本进行了Circle-seq分析，得到了HGSOC原发和转移性组织的eccDNA表达谱。结果显示，所有样本鉴定出194955个eccDNA，说明在HGSOC组织中有丰富的eccDNA表达。该研究还通过与RNA-seq联合分析鉴定了一个名为DNMT1circle10302690-10302961的新型eccDNA，可以作为HGSOC转移和预后的潜在标志物或治疗性临床靶点。

图1. Circle-seq流程图

案例2：Circle-seq与转录组整合分析揭示eccDNA参与中国松的维管形成层年周期调控过程

原文：Integration Analysis of Circle-Sequencing and Transcriptome Reveals Extrachromosomal Circular DNA Is Involved in the Regulation of Vascular Cambium Annual Cycle in Chinese Pine

发表时间：2025/04/09

发表期刊：Plant, Cell & Environment

影响因子：6.3

发表单位：北京林业大学

eccDNA在人类和动物的基因组复制、免疫应答和细胞通讯中起着重要作用。最近，在拟南芥、长穗苋和水稻中也发现了eccDNA的存在。然而，eccDNA是否存在于木本植物中并发挥作用仍然是个谜。该研究将Circle-seq应用到木本植物中国松发现eccDNA广泛存在于维管形成层年周期的整个过程中，参与其调控过程。进一步通过Circle-seq与转录组整合分析发现，差异表达的eccDNA及其注释基因在休眠期的动态变化比其他时期更为显著。这些结果为eccDNA影响维管形成层发育的重要机制提供了新的认识，加深了人们对eccDNA在树木可塑性中作用的理解。

图2. Circle-seq检测eccDNA的程序图

图2. Circle-seq检测eccDNA的程序图
云序优势：

1.环状DNA高效纯化及检出

云序生物采用A&A Biotechnology的纯化柱（Plasmid Mini AX; A&A Biotechnology）是绝大部分环状DNA高分文章中所使用的纯化柱，被Springer Protocols收录进入《DNA Electrophoresis Methods and Protocols》实验指南手册，是教科书级别的环状DNA纯化手段。后续高效地富集环状DNA，环状DNA检出率高。云序生物是该品牌纯化柱在国内的专属总代理。

2.一站式服务

客户只需提供细胞、组织或基因组DNA，云序生物为您完成“样品准备→环状DNA富集→文库制备→上机测序→数据分析/PCR验证”整套服务流程。

3.专业的生物信息学分析

专业的生物信息学团队，开发了高效识别分析环状DNA的算法，满足客户的各类深入数据分析需求。

数据分析（仅供展示详见demo报告）

1.环状DNA注释表格

测序后首先可以得到一个详尽的环状DNA注释表格，列出每个样品中检测到的每个环状DNA所在的染色体、坐标，长度，表达丰度，相关基因注释, GO注释，Pathway注释等。

2.差异环状DNA注释表格

不同的样品分组间可以进行环状DNA丰度的差异比较，通过差异倍数、p值、关联基因筛选关键的环状DNA。

3.差异环状DNA所属基因的功能分析

对差异环状DNA所属基因进行GO功能和KEGG通路富集分析。

4.差异环状DNA散点图、火山图

展示不同样品分组间环状DNA的丰度差异。

5.Venn图

对不同分组中共有和特有的环状DNA个数的统计和展示。

6.长度及数量分布

对整体或单独样本中环状DNA的长度和数量进行统计和展示。

7.GC含量分布

各处理组eccDNA中GC的含量以及eccDNA 来源序列上下游GC含量分布图。

8.Motif分析

研究eccDNA junction位点附近的Motif，我们分别选取eccDNA坐标起点(start)和坐标终点(end)上下游两个方向10bp的序列。利用motif分析可以挖掘其修饰/结合偏好，进而锁定相关基因。

9.联合转录组关联分析

如果联合全转录组测序，可以将环状DNA与mRNA进行联合分析寻找相关性。
样本要求：

样品类型：

细胞、组织、基因组DNA。其它类型样品请详询。

样品量：

a）细胞：> 1×10^7

b）组织：> 200 mg

c）DNA：>=10 µg，溶于无菌水或 TE（PH = 8）（OD 260/280值应在1.7～2.0 之间；RNA 应该去除干净；不得有其它个体或其它物种的DNA污染）。

样品运输及保存：

样品运输：样品置于1.5mL Eppendorf管中，封口膜封好，干冰运输，DNA可用冰袋运输。

样品保存：细胞样品或新鲜组织块切块，液氮冻存后-80℃保存；DNA样品短期内可置于-20℃保存，避免反复冻融。