高分文章案例

 

案例1：恙虫病立克次体（Orientia tsutsugamushi）的Dual RNA-seq技术，揭示了宿主-病原体互作机制。

原文：Dual RNA-seq of Orientia tsutsugamushi informs on host-pathogen interactions for this neglected intracellular human pathogen

发表时间：2020年7月3日

发表期刊：Nature Communications

影响因子：15.7

发表单位：德国维尔茨堡大学

 

恙虫病立克次体（Orientia tsutsugamushi, Ot）是引发亚太地区致命恙虫病的专性胞内病原体，其研究长期面临两大技术瓶颈：一方面，Ot基因组近50%为重复序列且菌株间基因高度重排，导致传统遗传工具难以解析其转录调控；另一方面，因缺乏可操作遗传系统，毒力因子鉴定依赖单一组学，无法同步捕捉感染过程中宿主免疫应答与病原体适应性演化的动态互作。

本研究应用Dual RNA-Seq技术，同步解析Ot感染人脐静脉内皮细胞（HUVEC）时双方的转录组动态。测序结果发现，人脐静脉HUVEC在感染Ot的Karp或UT176菌株后，均展现出显著的促炎症反应转录特征。经典干扰素信号通路在Karp菌株感染中被显著激活，而UT176菌株感染也引发类似强度的通路响应，表明不同毒力菌株均能触发保守的I型干扰素防御机制。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

图1 Ot在HUVEC中诱导干扰素防御反应

 

案例2：HECTD3在细菌感染期间介导TRAF3多泛素化和I型干扰素诱导

原文：HECTD3 mediates TRAF3 polyubiquitination and type I interferon induction during bacterial infection

发表时间：2018年7月30日

发表期刊：Journal of Clinical Investigation

影响因子：13.6

发表单位：中科院昆明动物所

 

在抗细菌感染的天然免疫中，模式识别受体（PRR）信号诱导I型干扰素（IFN）产生需要接头蛋白TRAF3发生赖氨酸63连接（K63连接）的多泛素化。这种修饰促进TRAF3与下游激酶TBK1结合，形成激活复合物。然而，介导TRAF3这一关键K63多泛素化的具体E3连接酶尚不明确。

研究团队通过Dual RNA-seq发现，缺乏E3连接酶基因Hectd3的小鼠在感染胞内细菌Francisella novicida时，反而表现出更强的宿主防御能力，能有效限制细菌的传播。在没有HECTD3的情况下，I型IFN反应在体内和体外细菌感染期间都受损。HECTD3通过介导TRAF3在残基K138处的K63连接多泛素化来调节I型IFN的产生。HECTD3的催化结构域调节TRAF3K63多泛素化，从而使TRAF3-TBK1复合物形成。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

图2 HECTD3介导TRAF3 K63链泛素化修饰促进Ⅰ型干扰素产生

云序优势

1.核糖体去除痛点与低丰度RNA保留技术突破

在宿主-微生物互作研究中，有效去除宿主与病原体核糖体RNA（rRNA）的同时保留含量相对较低病原体RNA是建库前的关键瓶颈。

传统方法存在显著局限：

分步去除法：

需要依次清除宿主和病原体的rRNA，导致操作流程冗长； 多次纯化造成总RNA严重损耗，病原体mRNA等低丰度转录本大量流失。

DSN消化法：

依赖高浓度rRNA反转录形成的cDNA优先退火形成双链并被降解； 无法彻底清除残留rRNA，且引发高丰度mRNA/lncRNA的非特异性降解。

云序生物解决方案：一步高效去除技术！

广谱兼容性

采用商业化去核糖体试剂盒，适配动物、植物、微生物等多物种rRNA同步去除。

高效留存低丰度RNA

5分钟内一步完成双系统rRNA去除，避免多步操作带来的RNA降解，有效保留病原体中的低丰度RNA，显著提高微量样本的建库成功率。

2.UMI技术消除扩增误差

UMI通过对原始分子进行唯一标记，消除了PCR扩增偏好性，实现对原始分子的准确计数，显著提升中低丰度基因的定量准确性，彻底消除建库PCR扩增噪声与测序错误干扰。

3.一站式服务

客户只需提供组织、细胞或RNA，云序生物为您完成Dual RNA-seq全套实验服务，并根据客户需求进行个性化数据挖掘。

 

数据分析（仅供展示 详见demo报告）

一．分析项目

1.原始数据整理，过滤和质量评估；

2.序列匹配与数据统计；

3.宿主和微生物的基因组比对；

4.测序数据占比分析；

5.宿主和病原体mRNA识别、定量和注释；

6.宿主差异mRNA GO功能富集分析；

7.宿主差异mRNA Pathway通路分析；

8.宿主和病原体mRNA聚类图；

9.宿主和病原体mRNA散点图；

10.宿主和病原体mRNA火山图；

11.宿主和病原体GSEA富集分析图；

12.宿主和病原体WGCNA分析；

13.IGV可视化；

14.按照客户要求对测序数据进行个性化分析。

 

二．部分数据分析结果示例

1.宿主和细菌病原体测序reads占比

在Dual RNA-Seq分析中精确区分宿主与病原体reads占比是进行数据质控与实验可靠性验证的有效手段，并通过比例进行感染进程判断和病原体负载量化。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2.宿主差异mRNA的GO和Pathway通路分析

GO分析：GO为注释基因、基因产物和序列开发了一套结构化的、受控词汇表。云序生物利用差异富集峰对应的基因进行GO功能分析，以注释并推测这些富集峰可能参与的功能。

Pathway分析：KEGG PATHWAY是将基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学中的分子数据集映射到KEGG通路图上，以进行这些分子的生物学功能解释的过程。云序生物利用差异富集峰对应的基因进行通路分析，以注释并推测这些富集峰可能参与的通路。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3.宿主和病原体mRNA聚类图

宿主和病原体转录组的分层聚类揭示了每个样本中不同的mRNA表达谱，可以用于衡量样本或mRNA之间表达的相似性。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

4.宿主和病原体mRNA的火山图和散点图（以宿主为例）

快速直观地识别那些变化幅度较大且具有统计学意义的mRNA，了解基因的表达变化趋势，如上升或下降基因数量及变化集中区域。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

5.宿主和病原体GSEA富集分析图（以宿主为例）

基因集富集分析（GSEA）通过可视化的方式展示了宿主和病原体在特定条件下（如感染、药物治疗、不同时间点、不同病原体株系等）基因表达谱整体变化模式所指向的生物学通路，揭示宿主整体防御应答策略和病原体生存、复制和致病策略。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

6.宿主和病原体WGCNA分析（以宿主为例）

加权基因共表达网络（WGCNA）分析通过构建双方基因共表达网络，系统性揭示感染过程中宿主免疫应答通路与病原体毒力因子模块的协同演化规律。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

7.IGV可视化

IGV是一款基于Java程序的用于基因组数据可视化的软件，通过比较样品测序深度的差异，从而实现测序reads的可视化。

 

 

 

 

样本要求：

样品类型：

细胞、组织、总RNA、其他类型请电询。

样品量：

a) 细胞：> 2×10^6

b) 组织：> 50 mg

c) RNA：总量 > 2 µg，浓度 > 50 ng/µL

样品运输与保存：

样品运输：样品置于1.5 mL管或冻存管中，封口膜封好，干冰运输。

样品保存：

a）细胞样品或新鲜组织块可用TRIZOL或RNA保护剂处理，液氮速冻后-80℃保存；

b）RNA样品可溶于RNA-free的无菌水中，-80℃保存，避免反复冻融。

注：具体请联系销售或后台工作人员，查看《云序生物样品采集保存及运输指南》。