上海云序生物科技有限公司-microRNA测序

microRNA测序技术

产品概述：

云序生物依托标准化建库流程与前沿测序技术，提供高精准microRNA测序解决方案：采用商业化试剂盒进行小RNA提取，基于片段大小高效富集microRNA。测序完成后，利用已知microRNA的数据库进行注释，并对新型microRNA预测，进一步整合靶基因调控网络与通路富集模型，助力从基础研究到临床分子标志物的开发。

microRNA相关介绍

MicroRNA（miRNA）是一类长度为22nt的单链小分子RNA，广泛存在于动物、植物、病毒等多种有机体中。microRNA通常介导转录后基因沉默，通过与靶mRNA的结合，促使mRNA降解或是阻碍其翻译，从而抑制靶基因的表达。

1.microRNA的形成

microRNA编码序列首先由RNA聚合酶II(Pol II)在细胞核内转录成长链的初级转录本（pri-microRNA），该转录本随后被加帽和聚腺苷酸化。接着pri-microRNA被核内Microprocessor复合物（核心成分为核糖核酸酶Drosha及其辅因子DGCR8）切割，产生长度约为60–75 nt、具有发夹环结构的前体microRNA（pre-microRNA）。pre-microRNA通过Exportin 5主动转运出细胞核进入细胞质，随后由核糖核酸酶Dicer结合并切割,生成22 nt的双链结构，包含一条成熟链（master strand，即引导链）和一条互补链（passenger strand，即过客链）。microRNA双链被整合至RNA诱导沉默复合体（RISC）中，引导链被选择性保留并稳定结合于AGO，形成功能性miRISC复合物，而过客链通常被降解。

microRNA的形成与分泌

2.microRNA作用模式

microRNA通过与mRNA在3'端的UTR结合，在不减少mRNA数量的情况下达到抑制mRNA翻译蛋白的功能。一般成熟的microRNA有2~8位的seed种子区域，与AGO蛋白形成复合物后结合在3'的UTR区域。当这些成熟体microRNA和AGO蛋白形成复合物时，在3'端的UTR区域抑制mRNA的翻译。

microRNA作用模式

3.MicroRNA与癌症诊断

研究表明，microRNAs可释放到血液等体液中，作为循环microRNA，作为多种疾病的非侵入性生物标志物。microRNAs从细胞释放到胞外环境被认为源于多种机制：通过外泌体（exosomes）主动分泌、微泡（microvesicle）释放、以及蛋白质介导的转运（如高密度脂蛋白和AGO2蛋白）。这些载体可保护microRNA免受核酸酶和蛋白酶介导的降解，并在暴露于样本处理条件时稳定循环microRNAs的分子结构。

这种分子层面的稳定性和细胞特异性表达模式，为microRNA作为早期癌症检测的突破性生物标志物奠定分子基础。目前已在血液（血清及血浆）、唾液、尿液、粪便、卵泡液、滑膜液、胰液、胆汁、胃液等多种体液中成功分离出microRNA，并正探索其作为相关疾病生物标志物的临床应用价值。

microRNA作为多种癌症的分子标志物潜力

实验原理

云序生物microRNA测序实验流程如下：首先使用TRIzol试剂从样品中提取总RNA，从总RNA中富集长度小于200 nt的小RNA后，通过GenSeq® Small RNA Library Prep Kit 试剂盒按照说明书流程进行构建测序文库。其流程简述如下：3’and 5’接头被依次加到RNA样品上，加好接头的RNA被逆转录为cDNA，然后进行PCR扩增。最后，对质控合格的cDNA文库在Illumina NovaSeq X plus测序仪上进行高通量测序。

microRNA测序实验流程图

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1.小RNA组测序（Pandora-Seq）技术

客户能同时获得microRNA、piRNA、tsRNAs、rsRNAs等在内的所有数据，且云序具有最权威的sncRNA数据库，能更完整的呈现出小RNA全景图谱 2.mRNA测序技术

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3.外泌体RNA测序技术

通过外泌体RNA测序技术精准检测体液中的循环microRNA，探索其作为相关疾病生物标志物的临床应用价值。
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云序用户案例

案例1：TBK1介导的AGO2磷酸化修饰促进非小细胞肺癌中致癌miRISC形成

原文：Phosphorylation of AGO2 by TBK1 Promotes the Formation of Oncogenic miRISC in NSCLC

发表时间：2024年2月13日

发表期刊：Advanced Science

影响因子：14.1

发表单位：上海交通大学医学院

非小细胞肺癌（NSCLC）致死率高，且极易对现有靶向治疗产生耐药。相比传统药物，microRNA（miRNA）凭借高特异性、低毒性及易于递送等优势，正成为攻克肿瘤耐药的新希望；已有研究显示，某些致癌microRNA可直接助长EGFR突变型NSCLC对TK抑制剂的耐受。当前的核心任务，是筛选出兼具高特异、高效能且递送可行的microRNA靶点及其组合方案，从而为显著提升NSCLC患者的长期疗效开辟全新路径。

云序用户上海交通大学基础医学院余健秀教授团队研究发现，TBK1凭借激酶活性直接结合并磷酸化AGO2-S417，该修饰显著增强microRNA加载、双链解旋及miRISC装配，从而强化miR-21、let-7等介导的靶基因沉默，并驱动NSCLC细胞锚定非依赖性生长、侵袭及体内成瘤。microRNA-Seq结果显示AGO2 S417A细胞中致癌高丰度microRNA与AGO2结合显著下降；而AGO2-RIP-Seq与mRNA-Seq共同显示，磷酸化缺失使这些致癌microRNA的靶基因（集中于细胞周期、ECM及癌症核心通路）降解受阻，从而在转录组层面反向证实pS417-AGO2通过选择性增强致癌microRNA的程序性抑制加速NSCLC进展。

图1 与AGO2结合的前十个microRNA靶基因的分析

案例2：仿生纳米囊泡转化骨骼内皮相关分泌表型以治疗骨质疏松症

原文：Bioinspired Nanovesicles Convert the Skeletal Endothelium-Associated Secretory Phenotype to Treat Osteoporosis

发表时间：2022年7月8日

发表期刊：Acs Nano

影响因子：16

发表单位：上海交通大学医学院附属上海总医院

近些年来的研究发现，骨髓内皮细胞（BMECs）对骨髓微环境的稳态调节至关重要。BMECs能够分泌多种细胞因子，通过旁分泌作用调节骨代谢。因此，靶向BMECs并且调控其分泌功能，改善骨代谢微环境，有望成为治疗骨质疏松症的新的有效策略。然而，在此研究之前，纳米医学领域尚无关于靶向BMECs治疗骨代谢疾病的相关报道。

云序用户上海交通大学基础医学院附属上海总医院傅德皓教授课题组从低氧培养的人诱导多能干细胞来源内皮细胞（iPSCs-ECs）中连续挤出获得仿生纳米囊泡（BNVs）。透射电镜与动态光散射证实其粒径均一，且外膜高表达CXCR4，赋予其骨髓归巢与BMEC靶向能力。microRNA-Seq显示该囊泡富集miR-21-5p、miR-100-5p、miR-126-3p及miR-1246等兼具促血管新生和抗炎功能的microRNAs；BMEC摄取后显著上调TGF-β、IL-10和前列腺素E2，提示其在骨代谢调控中的潜在价值。

图2 靶向BMEC的纳米囊泡通过转换骨骼内皮相关分泌表型来治疗骨质疏松症
云序优势：

全面捕获：

一次性无偏好地捕获样本中所有已知与未知的microRNA，同时完成定量、序列检测、新microRNA发现及差异分析。

高效富集：

采用商业化试剂盒进行小RNA提取，基于片段大小高效富集microRNA，提高测序质量。

一站式服务：

客户只需提供细胞、组织、体液或总RNA，云序生物为您完成从样品准备，文库制备，上机测序到数据分析的整套服务流程。

专业的生物信息学分析：

云序生物具有专业的生物信息学团队，能够满足客户的各类深入数据分析要求。

数据分析（仅供展示详见demo报告）

一．分析项目

1.原始数据质控（去接头，去低质量reads），数据产出统计；

2.已知microRNA的比对，通过miRBase等microRNA的数据库进行注释；

3.新microRNA预测；

4.microRNA表达分析；

5.microRNA差异表达分析；

6.差异microRNA靶基因预测；

7.差异microRNA靶基因的GO功能分析；

8.差异microRNA靶基因的Pathway分析；

9.差异microRNA靶基因网络图；

10.差异microRNA聚类热图；

11.microRNA火山图；

12.microRNA散点图；

13.按照客户要求对测序数据进行个性化分析。

二．部分数据分析结果示例

1.新microRNA预测

利用多个数据库进行新microRNA预测，以获得可能的新microRNA。

2.差异microRNA鉴定

对于两组样品，利用标准化的reads数，计算倍数变化（fold change）和P-value，一般以倍数变化>= 2.0，P-value <= 0.05作为差异microRNA筛选阈值，为您筛选差异microRNA。

3.差异表达microRNA靶基因预测

microRNA能够通过碱基互补配对，靶向mRNA，并调控mRNA表达。云序生物整合了权威microRNA靶基因预测软件，并对软件的重叠结果作为microRNA靶基因预测的最终结果。

4.microRNA靶基因网络图

根据预测得到的microRNA靶基因，选取miRNA预测排名前十位的靶基因，利用cytoscape软件绘制microRNA-gene网络图。

5.差异microRNA靶基因的GO和Pathway通路分析

GO分析：

GO为注释基因、基因产物和序列开发了一套结构化的、受控词汇表。云序生物利用差异富集峰对应的基因进行GO功能分析，以注释并推测这些富集峰可能参与的功能。

Pathway分析：

KEGG PATHWAY是将基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学中的分子数据集映射到KEGG通路图上，以进行这些分子的生物学功能解释的过程。云序生物利用差异富集峰对应的基因进行通路分析，以注释并推测这些富集峰可能参与的通路。
样本要求：

样品类型：
血清、血浆、细胞、组织、总RNA、其他类型请电询。

样品量：

a) 细胞：> 2×10^6

b) 组织：> 50 mg

c) 全血> 2 ml (推荐用紫色盖EDTA抗凝采血管，不可用绿色盖肝素抗凝管)

d) RNA：总量 > 2 µg，浓度 > 50 ng/µL

注：上述样本要求适用于常规细胞或组织样本，特殊样本类型（如骨组织、脂肪等核酸含量较少的样本）请致电021-64878766详询。

样品运输与保存：

样品运输：

样品置于1.5 mL管或冻存管中，封口膜封好，干冰运输。

样品保存：

a）细胞样品或新鲜组织块可用TRIZOL或RNA保护剂处理，液氮速冻后-80℃保存；

b）全血样品采集后，转移至冻存管中，-80℃保存，避免反复冻融；

c）RNA样品可溶于RNA-free的无菌水中，-80℃保存，避免反复冻融。

注：具体请联系销售或后台工作人员，查看《云序生物样品采集保存及运输指南》。