上海云序生物科技有限公司-小RNA组测序（Pandora-Seq）

小RNA组测序（Pandora-Seq）技术

技术简介：

非编码小RNA（small non-coding RNAs，sncRNAs）是一类长度小于200 nt、不编码蛋白质的RNA分子，根据来源可分为miRNA、piRNA、tsRNAs（包括tRF和tiRNA）、rsRNA和snRNA等多种类型。sncRNAs广泛存在于各类生物中，包括细菌、古细菌和真核生物。不同类别的sncRNAs在长度、功能及调控机制上存在显著差异，参与诸如免疫紊乱、代谢性疾病和恶性肿瘤等多种疾病的发生发展过程，并显示出作为诊断生物标志物和治疗靶点的巨大潜力，具有重要的科学研究与临床应用价值。

云序生物提供的小RNA组测序技术（Pandora-Seq）可同时检测miRNA、piRNA、tsRNAs和rsRNAs，为系统解析sncRNA的表达谱、发掘疾病相关分子标志物及探索新的治疗策略提供高效、全面的技术支撑。

1.miRNA (miRNA)

miRNA是一类长度为21-23nt的内源性非编码小RNA，由细胞核内编码miRNA的基因转录产生初级转录本（pri-miRNA），经Drosha酶加工成前体（pre-miRNA），再输出到细胞质中由Dicer酶最终切割成熟。miRNA通过与靶mRNA的结合，促使mRNA降解或是阻碍其翻译，从而抑制靶基因的表达，miRNA参与细胞增殖、凋亡、分化、代谢、发育等各种生物学过程，其表达失调与癌症、神经性疾病等多种疾病密切相关，可以作为生物标志物或疾病调控因子发挥作用。

2.piRNA (PIWI-interacting RNA)

piRNA是一类长为21-35nt的非编码小RNA，主要来源于基因组中的分散的重复序列簇，其生成过程不依赖于Dicer酶，而是通过与PIWI蛋白家族成员结合后被切割加工成熟。piRNA与PIWI蛋白形成piRNA复合物（piRC），以表观遗传调控和转录后沉默的方式抑制转座子的活性，从而维持基因组的完整性和稳定性。piRNA在配子发生、生殖细胞发育和维持生育能力中扮演着“基因组卫士”的角色，参与恶性肿瘤的增殖、侵袭、转移等发生发展过程等，可有望成为恶性肿瘤早期诊断及预后评估的生物标志物和新型治疗靶点。

3.tsRNAs (tRNA-derived small RNAs)

tsRNAs是近期发现的一类来源于tRNA的新型小RNA，长度在16-50 nt，由不同的酶精确切割不同的tRNA或者tRNA前体产生，其中包括tiRNA和tRF等。tsRNAs不仅在细胞应激（如缺氧、营养缺乏）响应中产生，参与调控翻译抑制和应激颗粒的形成，还能像miRNA一样调控mRNA的稳定性，并影响细胞增殖、凋亡和代谢等过程。其表达变化与肿瘤、神经退行性疾病等密切相关，不仅可作为疾病诊断的生物标志物，还具有治疗潜能。

4.rsRNAs (rRNA-derived small RNAs)

rsRNA是由rRNA的特异性切割产生的，长度范围多在15-50 nt之间。现在对rsRNAs的研究主要集中在精子发生方面，rsRNAs在成熟精子中大量表达，且对环境敏感，且与精子质量和男性生育能力有关。rsRNAs也构成精子RNA密码，将性状传递给受精卵并影响早期胚胎发育。rsRNAs在肿瘤发生中的潜在作用尚未得到广泛的探讨，仅有一项研究表明，一种rsRNA-28S促进细胞增殖，抑制非小细胞肺癌细胞的凋亡。

相关产品：

piRNA测序

piRNA（Piwi-interacting RNA）是一类长度约为24–31核苷酸的小型非编码RNA，在生殖细胞和体细胞中广泛表达并参与多种生物学过程的调控。云序生物的piRNA测序服务通过最新的数据库信息全面分析样品中的所有piRNA，并预测piRNA的靶基因，为研究其功能及调控机制提供有力手段。

miRNA测序

MicroRNA（miRNA）是一类长度为22nt的单链小分子RNA，通常介导转录后基因沉默，通过与靶mRNA的结合，促使mRNA降解或是阻碍其翻译，从而抑制靶基因的表达。云序生物采用商业化试剂盒进行小RNA提取，基于片段大小高效富集microRNA。测序完成后，利用已知microRNA的数据库进行注释，并对新型microRNA预测，进一步整合靶基因调控网络与通路富集模型，助力从基础研究到临床分子标志物的开发。

tiRNA&tRFs测序

tRF和tiRNA，是一类来源于成熟tRNA或前体tRNA加工过程的小RNA。能够通过与蛋白质或mRNA发生多种机制的相互作用，在翻译抑制、基因表达调控、细胞周期进程、以及染色质和表观遗传修饰等方面发挥重要的生物学功能。云序生物tiRNA&tRFs测序技术采用优化的建库流程，开发了专门的去甲基化处理与末端修饰处理方案，在总RNA的基础上直接进行加接头建库，减少实验误差，确保研究结果的全面性和可靠性。

实验原理

云序生物的Pandora-seq是通过对15-50nt区段的小RNA进行连续酶学处理（T4PNK、AlkB），促进接头连接、去除影响测序的修饰，从而实现RNA链的完全逆转录，最终完整的呈现出小RNA图谱。

酶处理：

T4PNK处理连接将3'末端的3'-P和2'，3'-cP转化为3-OH，将5'端的 5'-OH转换为5'-P，解决末端修饰导致接头无法连接问题；

AlkB处理以去除m1A、m3C等RNA修饰，解决反转录过程受到抑制的难题。

图1 Pandora-seq的酶处理过程

实验流程包括：sncRNAs提取→T4PNK酶处理→AlkB酶处理→加接头→反转录成cDNA→PCR扩增→上机测序→数据处理

图2 Pandora-seq流程图
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高分文章案例

案例1：sncRNAs可作为癌症诊断和预后的生物标志物

原文：A novel class of tsRNA signatures as biomarkers for diagnosis and prognosis of pancreatic cancer

发表时间：2021年7月17日

发表期刊：Molecular Cancer

影响因子：33.9

发表单位：南京中医药大学

南京中医药大学麻彤辉教授团队在本研究中揭示了血清中一类新的tsRNA，可以作为预测胰腺癌(Pancreatic cancer, PC)患者术后生存时间的生物标志物。研究团队利用RNA测序、qRT-PCR和原位杂交技术鉴定了人血清、组织、癌细胞和小鼠模型中PC相关的tsRNA特征。使用RNA杂交、GO和KEGG来分析靶基因及其相关的生物学过程，数据表明两种tsRNA在胰腺癌中发挥肿瘤启动子的作用。根据分析血清和癌组织中tsRNAs谱的改变，发现了tRF-Pro-AGG-004和tRF-LeuCAG-002这两种tsRNA有望作为PC早期诊断和预后的新生物标志物。

图1 从PC患者的血清样本中鉴定新的tsRNA生物标志物

案例2：Pandora-Seq发现sncRNAs的变化与后代代谢紊乱相关

原文：Paternal phthalate exposure-elicited offspring metabolic disorders are associated with altered sperm small RNAs in mice

发表时间：2023年1月23日

发表期刊：Environment International

影响因子：9.7

发表单位：加州大学河滨分校

加州大学河滨分校的研究团队探讨了父系小鼠暴露于邻苯二甲酸二环己酯（DCHP）对其F1和F2代后代代谢健康的不利影响。研究发现，父本DCHP暴露会导致F1后代出现胰岛素抵抗加剧和胰岛素信号受损，但不影响饮食诱导的肥胖。通过Pandora-seq技术，研究人员发现DCHP引起了精子中tsRNA/rsRNA景观的改变，这些变化在传统RNA测序中无法被检测到，且可能与DCHP诱发的不良代谢效应相关。进一步分析表明，精子中的非编码小RNA（包括tsRNA和rsRNA）在父系获得性代谢疾病的隔代遗传中起重要作用。此外，父系DCHP暴露还会在F2代中引发性别特异性的跨代不良反应，并在F2雌性后代中导致葡萄糖耐受不良。

图2 Pandora-seq鉴定DCHP处理的父系精子中显著改变的tsRNAs和rsRNA
云序优势：

突破修饰障碍：

云序生物针对小RNA丰富的碱基修饰及末端修饰，进行专门的去甲基化处理与末端修饰处理方案，攻克了RNA修饰带来的测序障碍，让传统方法漏检的修饰sncRNA（如tsRNA、rsRNA）能被高效捕获。

检测全面：

客户能同时获得miRNA、piRNA、tsRNAs、rsRNAs等在内的所有数据，完整的呈现出小RNA全景图谱。

一站式服务：

云序生物提供从样本到分析的全流程服务，客户仅需提供组织或总RNA样本，我们即可完成样品准备、文库构建、上机测序及数据分析全部环节。依托专业的生物信息学团队，我们能够满足各类高级和定制化的数据分析需求，助力客户高效推进研究进程。

数据分析（仅供展示详见demo报告）

一．分析项目

1.原始数据质控（去接头，去低质量reads），数据产出统计；

2.新miRNA预测；

3.miRNA识别与注释；

4.差异miRNA识别与注释；

5.差异miRNA靶基因预测；

6.差异miRNA靶基因GO功能富集分析；

7.差异miRNA靶基因KEGG通路分析；

8.miRNA聚类图；

9.miRNA散点图；

10.miRNA火山图；

11.新piRNA预测；

12.piRNA的识别与注释；

13.差异piRNA的识别与注释；

14.差异piRNA靶基因预测；

15.差异piRNA靶基因GO功能富集分析；

16.差异piRNA靶基因KEGG通路分析；

17.piRNA聚类图；

18.piRNA散点图；

19.piRNA火山图；

20.tsRNA识别与注释；

21.差异tsRNA识别与注释；

22.差异tsRNA靶基因预测；

23.tsRNA靶基因GO功能分析；

24.tsRNA靶基因KEGG通路分析；

25.tsRNA聚类图；

26.tsRNA散点图；

27.tsRNA火山图；

28.rsRNA识别与注释；

29.差异rsRNA识别与注释；

30.按照客户要求对测序数据进行个性化分析。

二．部分数据分析结果示例（以miRNA分析结果为例）

1.新miRNA预测

利用多个数据库进行新miRNA预测，以获得可能的新miRNA。

2.差异miRNA鉴定

利用标准化的reads数，计算倍数变化（fold change）和P-value，一般以倍数变化>= 2.0，P-value <= 0.05作为差异miRNA筛选阈值，筛选差异miRNA。

3.差异表达miRNA靶基因预测

miRNA能够通过碱基互补配对，靶向mRNA，并调控mRNA表达。云序生物整合了权威miRNA靶基因预测软件，对差异上调/下调miRNA进行靶基因预测。

4.差异miRNA靶基因的GO和Pathway通路分析

GO分析：GO为注释基因、基因产物和序列开发了一套结构化的、受控词汇表。云序生物对差异miRNA的靶基因进行GO功能分析，以注释并推测可能参与的功能。

Pathway分析：KEGG PATHWAY是将基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学中的分子数据集映射到KEGG通路图上，以进行这些分子的生物学功能解释的过程。云序生物对差异miRNA的靶基因进行通路分析，以注释并推测可能参与的通路。
样本要求:

样品类型：

血清、血浆、细胞、组织、总RNA、其他类型请电询。

样品量：

a) 细胞：> 2×10^6

b) 组织：> 50 mg

c) 全血> 2 ml (推荐用紫色盖EDTA抗凝采血管，不可用绿色盖肝素抗凝管)

d) RNA：总量 > 2 µg，浓度 > 50 ng/µL

样品运输与保存：

样品运输：

样品置于1.5 mL管或冻存管中，封口膜封好，干冰运输。

样品保存：

a）细胞样品或新鲜组织块可用TRIZOL或RNA保护剂处理，液氮速冻后-80℃保存；

b）全血样品采集后，转移至冻存管中，-80℃保存，避免反复冻融；

c）RNA样品可溶于RNA-free的无菌水中，-80℃保存，避免反复冻融。

注：具体请联系销售或后台工作人员，查看《云序生物样品采集保存及运输指南》。