• DRIPc-Seq技术

     

     

     

    技术简介：

     

    R-loop又称R环，是含有DNA-RNA双链和被置换的DNA单链组成的特殊三链核酸结构。R-loop广泛存在于各种生物的基因组中，包括细菌、酵母、植物和人类等，其形成既取决于DNA序列特征，也受拓扑结构影响。它通常会出现在基因密度高的活跃转录的起始区和高GC区域，在调控基因转录和影响基因组稳定性方面起着重要作用。

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    R-loop结构示意图

     

    R-loop可通过顺式（cis）和反式（trans）形成，顺式R-loop是当RNA聚合酶转录时，新生RNA退火至RNAPII后面的DNA模板链上；反式R-loop是由RNA和远处的DNA链杂交形成，例如基于非编码RNA (non-coding RNA，ncRNA)和向导RNA（gRNA）的R-loop。

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    R-loop形成示意图

     

    根据R-loop的作用，可将其大致分为生理性或“调节性”的R-loop和病理性或“非计划性”R-loop。调节性R-loop与基因调节和基因组稳定性相关，通过调节转录活性、复制、重组、着丝粒功能和DNA编辑等来调节基因活性。同时，调节性R-loop还通过促进修复DNA双链断裂（DSB）和短端粒结构来稳定基因组。非计划性R-loop是异常基因调控的来源，可导致基因组的不稳定，例如诱导DNA损伤。

     

    DRIPc-seq技术简介

    DRIPc-seq（DNA:RNA hybrid immunoprecipitation and sequencing）是一种高分辨率、链特异性的全基因组 R-loop RNA 链检测技术。该方法先用温和裂解获得高完整性染色质，随后利用 S9.6 抗体（对 RNA-DNA 杂合链具有亚纳摩尔亲和力，对双链 DNA 几乎无亲和）特异性富集 R-loop；通过 DNase I 消化去除 DNA，仅保留杂合链中的 RNA进行测序，获得全基因组 RNA 链的 R-loop 分布图谱。

     

    相关产品

    1.ssDRIP-Seq：ssDRIP-Seq是一种用于检测R-loop结构中DNA的测序技术。DRIPc-Seq与ssDRIP-seq联合应用，可同时获得R-loop的DNA链特异性信息及对应RNA序列，实现R-loop DNA:RNA杂合链的“双端”解析，精确定位R-loop形成位点并鉴定其RNA组分，从而全面揭示R-loop在转录调控与基因组稳定性维持中的分子机制。

    2.R-loop Cut&Tag：R-loop Cut&Tag用于检测细胞内R-loop分布位点。R-loop Cut&Tag能在低起始量下依然保持高灵敏度和特异性，有效富集R-loop信号。实验重复结果一致性高，peak富集好，适用于研究者快速高效地获得细胞内R-loop分布位点。

     

    DRIPc-seq实验流程

    1）DNA 提取：温和裂解细胞，保持染色质完整，保留天然 R-loop 结构。

    2）片段化：采用限制性内切酶将染色质 DNA 切成 100–500 bp 片段。

    3）免疫沉淀：加入 S9.6 抗体，富集 DNA:RNA 杂合链，经磁珠分离并充分洗涤。

    4）RNA 释放：DNase I 处理去除 DNA，仅保留杂合链中的 RNA。

    5）逆转录：以 dUTP 合成第二条链，确保方向性。

    6）链特异处理：UNG 切除 dUTP，保留第一链 cDNA。

    7）文库扩增：以单链 cDNA 为模板进行 PCR 扩增，构建链特异性测序文库。

    8）高通量测序：对文库进行高通量测序，获得 R-loop RNA 链的链特异性全基因组图谱。

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    DRIPc-seq流程图

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  • 高分文章案例

     

    案例一：基于S9.6抗体的高分辨率链特异性R-loop全基因组定位技术

    原文：High-resolution, strand-specific R-loop mapping via S9.6-based DNA-RNA immunoprecipitation and high-throughput sequencing

    发表时间：2019/5/3

    发表期刊：Nature Protocols

    影响因子: 16.0

    发表单位：加利福尼亚大学

    DRIP-seq 与 DRIPc-seq 的 R-loop 定位技术可用于在任意目标基因组中定量检测 R-loop 的稳态分布，并解析遗传扰动（基因敲除或敲低）或化学处理（药物、激素）所引发的全局变化或动态。已发表的应用实例包括：雌激素诱导人乳腺癌细胞转录后 R-loop 的改变，以及在人 HEK293 细胞中沉默 DNA 拓扑异构酶 1 的后果。只要起始材料充足，这两种方法即可适用于任何细胞类型；目前已在鼠源细胞及裂殖酵母中成功绘制了 R-loop 图谱。

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    图1. DRIPc-seq得到的R-loop图谱

     

     

    案例二：S9.6抗体对双链RNA的亲和性影响裂殖酵母R-loop的精准定位

    原文：The Affinity of the S9.6 Antibody for Double-Stranded RNAs Impacts the Accurate Mapping of R-Loops in Fission Yeast

    发表时间：2017/12/28

    发表期刊：Journal of Molecular Biology

    影响因子: 4.5

    发表单位：加利福尼亚大学

    该研究采用基于S9.6抗体的DRIPc-seq技术，对R-loop中的RNA链进行测序，获得接近单核苷酸分辨率的链特异性 R-loop 图谱。出乎意料的是，初步DRIPc-seq 结果主要检出 RNase H 耐受而对 RNA 外切体敏感的 RNA，这些 RNA 同时映射到两条 DNA 链，且表现为 RNA:RNA 双链（dsRNA）特征，提示 dsRNA 在裂殖酵母中广泛存在。体外实验证实，S9.6 可免疫沉淀 dsRNA，且 dsRNA 会干扰其与 R-loop 的结合。在 DRIPc-seq 前以 RNase III 去除 dsRNA，可在全基因组范围内获得对 RNase H 水平敏感、且具备典型 R-loop 特征的真实 R-loop 位点。该研究为设计 R-loop 功能实验策略提供了重要启示。

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    图2. 裂殖酵母中进行DRIPc-seq

     

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    云序技术优势：

    1.一站式服务

    客户只需提供细胞，组织或IP富集的RNA，云序生物为您完成从样品处理，文库制备，上机测序到数据分析整套服务流程。

    2.灵敏度高

    DRIPc-seq能够得到全基因组 RNA 链的 R-loop 分布图谱。采用链特异性建库，获得链特异性R-loop分布图谱。

    3.严格的质控

    云序生物在实验的各个关键步骤加入了一系列质控点，全程监控实验质量，确保客户得到优质的数据。

    4.专业的生物信息学分析

    云序生物拥有专业的生物信息学团队，能够满足客户的各类深入数据分析需求。

     

    数据分析（仅供展示 详见demo报告）

    一、分析内容

    1.原始数据整理，过滤和质量评估，去除低质量reads

    2.序列匹配与数据统计

    3.R-loop区mRNA的识别与注释

    4.R-loop区差异mRNA的筛选

    5.R-loop区差异mRNA相关基因的GO富集分析

    6.R-loop区差异mRNA相关基因的KEGG通路分析

    7.motif分析

    8.韦恩图

    9.Classification

    10.Metagene

    11.按照客户需求个性化数据分析

     

    二、部分数据分析结果示例

    1.R-loop区差异mRNA的筛选

    云序生物使用diffReps软件进行R-loop区差异mRNA的识别。

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    2.R-loop区差异mRNA相关基因的GO富集分析

    基因本体论（Gene Ontology，GO）计划分成3个部分：分子功能（Molecular Function，MF）、细胞组分（Cell Component，CC）、生物过程（Biological Process，BP）。云序生物对R-loop区差异mRNA相关基因进行GO分析。

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    3.R-loop区差异mRNA相关基因的KEGG通路分析

    云序生物利用R-loop区差异mRNA相关基因进行通路分析，以注释并推测这些R-loop区差异mRNA相关基因可能参与的通路。

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    4.motif分析

    用于展示R-loop区mRNA的序列Motif。

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    5.韦恩图

    直观展示各个分组中独有和特有R-loop富集峰的情况。

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    6.Classification

    用于展示不同区域的R-loop的富集程度。

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    7.Metagene

    用于展示5’UTR、CDS、3’UTR中R-loop的富集峰密度。

     

     

     

     

  • 样品要求:

    样品类型

     细胞、组织、gDNA、IP后DNA

    样品量：

    a)细胞：≥2×10^7（要求细胞活率≥90%）

    b)组织：≥400 mg

    c)gDNA：≥10µg

    d)IP后DNA：≥50 ng

    样品的运输与保存：

    样品运输：样品置于1.5 mL管或冻存管中，封口膜封好，干冰运输。

    样品保存：DRIPc-seq需要保持一定的活细胞数量，因此在细胞采集时需要程序性降温冻存，具体流程参照云序生物样品采集、保存及运输指南。

技术服务

Technical Service

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