上海云序生物科技有限公司-ssDRIP-Seq

ssDRIP-Seq技术

技术简介：

R-loop又称R环，是含有DNA-RNA双链和被置换的DNA单链组成的特殊三链核酸结构。R-loop广泛存在于各种生物的基因组中，包括细菌、酵母、植物和人类等，其形成既取决于DNA序列特征，也受拓扑结构影响。它通常会出现在基因密度高的活跃转录的起始区和高GC区域，在调控基因转录和影响基因组稳定性方面起着重要作用。

R-loop结构示意图

R-loop可通过顺式（cis）和反式（trans）形成，顺式R-loop是当RNA聚合酶转录时，新生RNA退火至RNAPII后面的DNA模板链上；反式R-loop是由RNA和远处的DNA链杂交形成，例如基于非编码RNA (non-coding RNA，ncRNA)和向导RNA（gRNA）的R-loop。

R-loop形成示意图

根据R-loop的作用，可将其大致分为生理性或“调节性”的R-loop和病理性或“非计划性”R-loop。调节性R-loop与基因调节和基因组稳定性相关，通过调节转录活性、复制、重组、着丝粒功能和DNA编辑等来调节基因活性。同时，调节性R-loop还通过促进修复DNA双链断裂（DSB）和短端粒结构来稳定基因组。非计划性R-loop是异常基因调控的来源，可导致基因组的不稳定，例如诱导DNA损伤。

相关产品

1.DRIPc-Seq：

DRIPc-Seq是一种用于检测R-loop结构中RNA的测序技术。ssDRIP-seq与DRIPc-Seq联合应用，可同时获得R-loop的DNA链特异性信息及对应RNA序列，实现R-loop DNA:RNA杂合链的“双端”解析，精确定位R-loop形成位点并鉴定其RNA组分，从而全面揭示R-loop在转录调控与基因组稳定性维持中的分子机制。

2.R-loop Cut&Tag：

R-loop Cut&Tag用于检测细胞内R-loop分布位点。R-loop Cut&Tag能在低起始量下依然保持高灵敏度和特异性，有效富集R-loop信号。实验重复结果一致性高，peak富集好，适用于研究者快速高效地获得细胞内R-loop分布位点。

ssDRIP-seq技术

ssDRIP-seq（single-strand DNA ligation-based library construction of DNA:RNA hybrid immunoprecipitation and sequencing）是一种专门用于捕获并测序R-loop结构中DNA链的高通量技术。该方法通过温和裂解获得染色质，利用S9.6抗体特异性富集DNA:RNA杂合链，随后以单链DNA为模板进行链特异性接头连接与扩增，实现对R-loop的精准、高效、可重复的全基因组检测，并提供DNA链方向信息，为研究转录调控、基因组稳定性及染色质结构提供关键数据。

实验流程如下：

1）DNA提取：采用温和裂解条件获取高完整性染色质，最大限度保留天然R-loop结构。

2）片段化：使用限制性内切酶对染色质DNA进行片段化。

3）免疫沉淀：加入S9.6抗体，特异性捕获DNA:RNA杂合链（R-loop），经磁珠分离并充分洗涤，去除非特异性结合。

4）接头连接：将Adp1连接至ssDNA的3'端，Adp2连接至5'端，实现链特异性标记。

5）文库扩增：以连接产物为模板进行PCR扩增，构建链特异性测序文库。

6）高通量测序：对文库进行高通量测序，获得链特异性R-loop分布图谱。

ssDRIP-seq流程图
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高分文章案例

案例一：ssDRIP-seq——的多物种全基因组R-loop定量、便捷、高效分析技术

原文：Quantitative, Convenient, and Efficient Genome-Wide R-Loop Profiling by ssDRIP-Seq in Multiple Organisms

发表时间：2022/6/16

发表期刊：Methods in Molecular Biology

发表单位：清华大学

R-loop是一种由一条单链DNA与一条DNA:RNA杂合链构成的三链染色质结构，在多种生物体内发挥多样且关键的生物学功能。该研究提供了一套简洁且高效的操作流程，可在不同物种中实现全基因组水平的链特异性R-loop分析。其要点为：先提取并片段化基因组DNA，随后利用DNA:RNA杂合链抗体进行免疫沉淀，再通过单链DNA接头连接与高通量测序完成文库构建（命名为ssDRIP-seq）。配合简洁的分步式生物信息学分析流程，该方法能够以高分辨率提供全面的链特异性R-loop信息。ssDRIP-seq已成功应用于从原核生物大肠杆菌到真核生物酿酒酵母、哺乳动物细胞系与组织，以及植物拟南芥和水稻的R-loop检测，表现出良好的重现性与灵敏度。

图1. 全基因组R-loop检测方法比较

案例二：R-loop是拟南芥基因组的常见染色质特征

原文：The R-loop is a common chromatin feature of the Arabidopsis genome

发表时间：2017/8/28

发表期刊：Nature Plants

影响因子：13.6

发表单位：清华大学

R-loop是由一条单链DNA与一条DNA:RNA杂合链构成的功能性染色质结构。该研究提出ssDRIP-seq技术，即基于单链DNA连接的全基因组R-loop鉴定文库构建方法。在拟南芥中的应用显示，ssDRIP-seq具有高效、低偏好性以及链特异性的优势。数据分析表明，拟南芥R-loop同时富集于AT和GC偏好区域，并以正义与反义方向形成；其显著富集于基因启动子及基因体，且与非编码RNA及重复序列区域高度关联。此外，R-loop与CG序列的DNA高甲基化呈负相关，并广泛分布于具有多种染色质修饰的区域，与激活或抑制状态的基因位点均表现出强烈相关性。该研究为阐明植物核基因组的形成及功能机制提供了新视角。

图2. 基于单链DNA建库的ssDRIP-seq原理图
云序技术优势：

1.一站式服务

客户只需提供细胞，组织或IP富集的DNA，云序生物为您完成从样品处理，文库制备，上机测序到数据分析整套服务流程。

2.灵敏度高

ssDRIP-seq能够得到全基因组范围内的R-loop图谱。采用链特异性建库，获得链特异性R-loop分布图谱。

3.严格的质控

云序生物在实验的各个关键步骤加入了一系列质控点，全程监控实验质量，确保客户得到优质的数据。

4.专业的生物信息学分析

云序生物拥有专业的生物信息学团队，能够满足客户的各类深入数据分析需求。

数据分析（仅供展示详见demo报告）

一、分析内容

1.原始数据整理，过滤和质量评估，去除低质量reads

2.序列匹配与数据统计

3.富集峰的识别和注释

4.差异富集区的识别和注释

5.差异富集区的GO富集分析

6.差异富集区KEGG通路分析

7.正义链peak motif分析

8.反义链peak motif分析

9.韦恩图

10.正义链基因组分布饼图

11.反义链基因组分布饼图

12.正义链染色体分布图

13.反义链染色体分布图

14.按照客户需求个性化数据分析

二、部分数据分析结果示例

1.差异富集峰的识别与注释

云序生物使用diffReps软件进行差异富集峰的识别。

2.差异富集区的GO富集分析

基因本体论（Gene Ontology，GO）计划分成3个部分：分子功能（Molecular Function，MF）、细胞组分（Cell Component，CC）、生物过程（Biological Process，BP）。云序生物对差异R-loop峰对应的基因进行GO分析。

3.差异富集区KEGG通路分析

云序生物利用差异R-loop峰对应的基因进行通路分析，以注释并推测这些差异R-loop峰对应的基因可能参与的通路。

4.正（反）义链peak motif分析

用于展示正（反）义链中R-loop位点的序列Motif

5.韦恩图

直观展示各个分组中正义链和反义链中独有和特有RLoop富集峰的情况。

6.正（反）义链基因组分布饼图

将peak匹配到各基因位置，统计各区域的peak所占比例，从总体上查看R-loop基因组特征。

7.正（反）义链染色体分布图

统计富集峰在各染色体上的位置，绘制各条染色体上富集峰分布的区域，从总体上探究peak的染色体分布偏好性。
样品要求:

样品类型

细胞、组织、gDNA、IP后DNA

样品量：

a)细胞：≥2×10^7

b)组织：≥400 mg

c)gDNA：≥10µg

d)IP后DNA：≥50 ng

样品的运输与保存：

样品运输：样品置于1.5 mL管或冻存管中，封口膜封好，干冰运输，DNA可使用冰袋运输。

样品保存：细胞样本或新鲜组织切块，液氮冻存后-80℃保存。DNA样品短期内可-20℃保存，避免反复冻融。