• RNA Pull-down技术

     

     

     

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    技术简介

    RNA pull-down是一种用于研究RNA-蛋白质相互作用的实验技术，广泛应用于基因表达调控研究。该技术通过生物素标记的RNA探针与细胞裂解液孵育，形成RNA-蛋白质复合物，再利用链霉亲和素标记的磁珠分离复合物。纯化产物可依据研究目的分别处理：若关注结合蛋白，可直接进行Western blot或质谱鉴定；若关注RNA互作网络，则使用Trizol提取RNA后进行测序分析，实现对RNA及蛋白质靶标的精准解析。

     

    相关产品

    1. RIP-Seq：

    RIP-Seq用于研究与已知蛋白互作的目标RNA分子。RNA-Pull-down与RIP-Seq联合应用，可相互补充和验证RNA与蛋白质的相互作用，全面覆盖互作组信息，提高对RNA-蛋白质复合物结构和功能的认识。

    2. RNA修饰测序：

    RNA修饰测序用于揭示RNA的修饰状态。RNA-Pull-down与RNA修饰测序联合应用，可以解析RNA修饰对其与蛋白质或其他RNA分子相互作用的影响，阐明RNA修饰在调控RNA互作网络中的作用。

     

    RNA pull-down技术原理：

    RNA pull-down技术基于RNA探针与目标RNA结合后，通过与链霉亲和素标记的磁珠相互作用，从复杂的生物样品中分离RNA-蛋白质复合物。具体步骤如下：

    1）生物素标记的阳性pull-down探针和阴性探针分别与链霉亲和素磁珠孵育结合。

    2）将结合探针的磁珠与细胞裂解液孵育，使RNA探针与RNA结合蛋白形成复合物。

    3）使用洗脱缓冲液将RNA-蛋白复合物从磁珠上洗脱。

    4）洗脱的复合物可通过SDS缓冲液进一步分离纯化蛋白，进行Western Blot和质谱分析，或通过Trizol试剂提取RNA。

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    RNA pull down流程图

     

     

     

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  • 云序用户案例

     

    案例一：钴通过FTO触发的自噬损害诱导神经退行性变：以TSC1为靶点且依赖于m6A-YTHDF2的方式

    原文：Cobalt induces neurodegeneration through FTO-triggered autophagy impairment by targeting TSC1 in an m6A-YTHDF2-dependent manner

    发表时间：2023/4/6

    发表期刊：Journal of Hazardous Materials

    影响因子：11.3

    发表单位：福建医科大学

     

     

    钴是医药和工业中应用最广泛的重金属污染物之一，过量暴露会危害人体健康，钴暴露人群已出现神经退行性症状，但其潜在机制尚不清楚。研究发现，N⁶-甲基腺苷（m6A）去甲基酶——脂肪质量和肥胖相关基因（FTO），通过损害自噬流介导钴诱导的神经退行性变。通过RNA pull-down实验，确认了FTO能够直接与TSC1 mRNA结合，进而调节其稳定性。研究表明中枢神经系统（CNS）中Fto特异性敲除会导致钴暴露小鼠出现严重的神经行为和病理损伤以及与TSC1相关的自噬受损。在髋关节置换术的患者中已证实FTO调控的自噬受损。该研究结果为m6A调控的自噬提供了新见解，通过FTO-YTHDF2靶向TSC1 mRNA稳定性揭示钴是一种新型表观遗传危害，可诱发神经退行性变，这些发现为髋关节置换术中神经退行性损伤患者的潜在治疗靶点提供了启示。

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    图1：FTO通过m6A-YTHDF2依赖的方式加剧自噬缺陷的示意图

     

     

    案例二：ALKBH5介导的HO-1 mRNA m6A修饰调控钴诱导的神经退行性损伤中的铁死亡

    原文：ALKBH5-mediated N6-methyladenosine modification of HO-1 mRNA regulates ferroptosis in cobalt-induced neurodegenerative damage

    发表时间：2024/7/20

    发表期刊：Environment International

    影响因子：9.7

    发表单位：福建医科大学

     

    该研究探讨了钴(Co)在体内和体外诱导神经退行性损伤中铁死亡的机制，重点关注m6A去甲基酶alkB同源物5(ALKBH5)的表观遗传调控作用。研究发现，血红素氧合酶-1（HO-1）是ALKBH5的直接靶基因，在减轻钴诱导的铁死亡中发挥关键作用。ALKBH5缺乏会通过m6A修饰影响HO-1的转录后调控，进而影响mRNA的稳定性、细胞内分布和选择性剪接，从而增加对钴诱导铁死亡的易感性。此外，研究还讨论了异构核糖核蛋白M（hnRNPM）可能通过m6A修饰调控HO-1 mRNA选择性剪接的潜在机制。该研究为理解钴诱导铁死亡的转录后调控机制提供了新的表观遗传学视角，并强调了环境危害在神经退行性损伤中的更广泛影响。该研究通过RNA pull-down鉴定了与HO-1 mRNA结合的蛋白质，明确结合蛋白的功能富集，进而深入研究了在钴诱导的铁死亡过程中调控HO-1选择性剪接的潜在机制。

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    图2：HO-1 mRNA pull-down分析结果

     

    云序用户文章列表

     

  • 云序优势：

    1.低丰度富集

    云序生物能够高效富集低丰度的靶蛋白-RNA复合物，有效解决生物样品中目标相互作用成分含量低的问题，确保从复杂样品中精准检测到靶蛋白-RNA复合物。

    2.一站式服务

    客户只需提供细胞、组织，云序生物为您完成RNA pull-down整套服务流程。

    3.具有成熟蛋白质组学平台

    云序生物具备完善的蛋白质组学平台，为RNA pull-down产物提供Western Blot及质谱鉴定服务，确保结果精准可靠，助力深入探索RNA-蛋白质相互作用。

    4.专业的生物信息学分析

    云序生物拥有专业的生物信息学团队，能够满足客户的各类深入数据分析需求。

     

    数据分析（仅供展示 详见demo报告）

    以下数据分析以RNA pull down MS为例。

    一、分析内容

    1.数据产出统计

    2.蛋白质鉴定结果

    3.蛋白质定量结果

    4.差异蛋白GO富集分析

    5.差异蛋白的Pathway富集分析

    6.聚类图

    7.散点图

    8.火山图

     

    1. 蛋白质谱分析

    云序生物使用MaxQuant v1.6.0.16软件分析原始数据，并利用其自带的算法鉴定多肽及蛋白质，给出相对定量信息（LFQ）。

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    2. 差异蛋白筛选

    云序生物使用倍数变化（2个样品，默认fold change=2.0）筛选差异蛋白质/多肽（具体以报告为准）。

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    3. 差异蛋白GO功能富集分析

    云序生物对差异蛋白进行GO分析，探究差异蛋白可能发挥的功能。

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    4. 差异蛋白的KEGG通路分析

    云序生物利用差异蛋白进行通路分析，以注释并推测这些差异蛋白可能参与的通路。

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    5. 聚类分析

    使用R中的heatmap2函数，以标准化信号进行差异蛋白质/多肽聚类，通常来讲，同组的样品能够聚在一个分枝中。

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    6. 散点图、火山图

    散点图根据差异蛋白倍数变化直观的展示各个分组差异蛋白分布情况。 火山图用于展示各个分组总体蛋白分布情况（注：需要各处理样本重复数量三个以上才可以绘制火山图）。

     

  • 样本要求:

    样品类型:
     细胞、组织、IP后RNA

    样品量：

    a)细胞：≥1×10^8（细胞活率≥90%）

    b)动物组织：≥500 mg

    c)植物组织：≥5 g

    d)IP后RNA：≥100 ng

    样品的运输与保存：

    样品运输：样品置于1.5 mL管或冻存管中，封口膜封好，干冰运输。

    样品保存：细胞、组织、RNA样品液氮速冻后置于-80℃保存。

技术服务

Technical Service

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