上海云序生物科技有限公司-m6A RNA修饰测序（m6A MeRIP-Seq）

m6A merip-seq（spike in plus）测序技术

m6A MeRIP-Seq 产品列表：

技术简介：

m6A甲基化修饰，即RNA分子腺嘌呤第6位氮原子上发生甲基化修饰(N6-methyladenosine，m6A)是真核生物mRNA上常见的一种转录后修饰，m6A在细胞加速mRNA代谢和翻译，以及在细胞分化、胚胎发育和压力应答等过程中起重要作用。 m6A MeRIP-Seq（Methylated RNA Immunoprecipitation，MeRIP）是研究转录组表观修饰的关键技术，基于m6A修饰抗体特异性识别并结合m6A修饰RNA的原理，以免疫共沉淀方法富集RNA片段，并配合高通量测序技术，实现转录组范围内甲基化的RNA区域的检测。MeRIP测序技术技术成熟、适用于各类分子(mRNA,LncRNA,circRNA,pri-miRNA等)。云序生物通过添加Spike-In实现更加准确的m6A检测。常规的MeRIP实验通过修饰抗体富集修饰RNA，众所周知，抗体特异性的强弱是决定MeRIP实验是否成功的关键，没有Spike-In，将难以确定实验是否成功、有效RNA是否富集，也难以确定RNA甲基化修饰的丰度和变化，那么就无法保证测序结果真实可靠、质量达标。

m6A MeRIP-seq流程图

相关产品：

1.单碱基m6A修饰测序GLORI-Seq：

GLORI（Glyoxal and nitrite-mediated deamination of unmethylated adenosine）技术是针对m6A修饰开发的单碱基检测技术。实现了真正意义的高效率、高灵敏度、高特异性、无偏好单碱基m6A位点检测，并对m6A位点的修饰水平进行绝对定量。

2.RNA修饰定量PCR：

MeRIP-qPCR是验证某目标基因上的某个修饰位点(以一小段区域的形式，MeRIP法精确不到单碱基)的修饰水平。得到的结果往往是一个%(IP/input)的数值，它体现的是该位点的修饰水平(可以理解为:这个转录本表达了很多条，其中这个位点有修饰的有多少条)。与普通qPCR验证基因表达水平的不同，普通PCR一般是验证基因的表达量(可以理解为:基因转录本表达了多少条)。

3.RNA修饰质谱：

云序生物RNA修饰质谱基于LC-MS/MS平台，能够同时检测m6A、m5c、ac4c等55种核酸修饰的整体水平。并进行精确的定量。

4.RNA修饰定量PCR芯片：

PCR芯片结合了实时定量PCR技术灵敏可靠和微阵列技术同时检测多个基因的优势，是分析特定信号通路或生物学过程中相关基因表达水平的有力工具。预制的PCR板,覆盖68个针对不同RNA修饰的Writers/Erasers/Readers基因。RNA修饰PCR芯片通过检测关键酶/蛋白的RNA表达变化，确定样品表型与特定RNA修饰的联系。
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云序用户案例

案例1：m6A-MeRIP-seq鉴定去甲基化酶ALKBH5在头颈鳞癌中调控免疫逃逸的关键靶点

原文：The m6A demethylase ALKBH5 promotes tumor progression by inhibiting RIG-I expression and interferon alpha production through the IKKε/TBK1/IRF3 pathway in head and neck squamous cell carcinoma

发表时间：2022/04/09

发表期刊：Molecular Cancer

影响因子：27.7

发表单位：上海交通大学医学院

非编码RNA m6A修饰在头颈鳞状细胞癌（HNSCC）中的功能尚不明确。本研究通过HNSCC组织芯片发现m6A整体水平下调及去甲基化酶ALKBH5的上调，并证实抑制ALKBH5可抑制肿瘤进展。利用m6A-MeRIP-seq等技术，我们揭示ALKBH5通过擦除DDX58/RIG-I mRNA上的m6A修饰，并经“阅读器”HNRNPC促进其成熟，从而抑制RIG-I介导的I型干扰素（IFNα）分泌和淋巴细胞浸润，最终导致免疫逃逸。这些结果共同阐明了ALKBH5通过m6A修饰依赖的DDX58/RIG-I/IFNα轴调控肿瘤免疫微环境的新机制，为靶向ALKBH5治疗HNSCC提供了理论依据。

HNSCC中m6A修饰的表征

案例2：利用m6A-MeRIP-seq解析超级增强子RNA修饰在胰腺癌中的致癌机制

原文：Super-enhancer RNA m6 A promotes local chromatin accessibility and oncogene transcription in pancreatic ductal adenocarcinoma

发表时间：2023/11/13

发表期刊：Nature Genetics

影响因子：30.8

发表单位：中山大学

本研究通过m6A-MeRIP-seq描绘了胰腺导管腺癌（PDAC）中超级增强子RNA（seRNA）m6A修饰的全景图，揭示了一个由m6A seRNA、H3K4me3修饰、染色质可及性和癌基因转录构成的调控轴。我们发现PDAC中过表达的丝切蛋白家族成员CFL1作为METTL3辅助因子，协助seRNA m6A甲基化形成。增多的seRNA m6A被阅读蛋白YTHDC2识别，进而招募H3K4甲基转移酶MLL1以共转录方式促进H3K4me3修饰。具有高水平H3K4me3的超级增强子可增强染色质可及性并促进癌基因转录。这些结果共同揭示了CFL1–METTL3–seRNA m6A–YTHDC2/MLL1调控轴在局部染色质状态和基因表达的表观遗传调控中的作用，深化了我们对超级增强子及其转录本功能的认识。

PDAC中seRNA的m6A修饰图谱及Metagene分析

云序用户m6A-MeRIP-seq高分文章列表：
云序优势：

1.MeRIP实验质控金标准 Spike-In

常规的MeRIP实验通过修饰抗体富集修饰RNA，众所周知，抗体特异性的强弱是决定MeRIP实验是否成功的关键，没有spike in，将难以确定实验是否成功、有效RNA是否富集，也难以确定RNA甲基化修饰的丰度和变化，那么就无法保证测序结果真实可靠、质量达标。云序生物m6A MeRIP-Seq(Spike-In Plus)测序在实验过程中加入两类人工合成的spike in，分别为阳性Spike-In（带m6A修饰的序列）和阴性Spike-In（不带修饰的序列），与样品一起进行MeRIP-Seq实验，根据Spike-In的检测信号对MeRIP实验进行质控，来确保实验流程的准确性、重复性及抗体的特异性。

2.超微量MeRIP-seq

云序生物超微量RNA甲基化测序（超微量MeRIP-seq）对免疫共沉淀和高通量测序步骤进行优化，克服常规抗体富集至少需要100μg总RNA的难题，仅需500ng总RNA既可实验。并适用于检测微量样本如血清、血浆和外泌体。

数据分析（仅供展示详见demo报告）

一、分析内容

1.原始数据整理，低质量reads过滤，数据质控

2.m6A修饰的识别

3.差异m6A修饰的识别

4.差异修饰基因GO富集分析

5.差异修饰基因KEGG通路分析

6.Motif分析

7.Venn韦恩图

8.Classifiaction分布

9.Metagene分析

二、部分数据分析结果示例

1.甲基化区域识别与注释

根据IP和Input中的clean reads在参考基因组上的富集情况的差异，识别IP样品中clean reads中发生了显著富集的区域，这个过程被称为修饰峰识别（peak calling）。云序生物使用MACS识别每个实验样本中的修饰区域（峰/peak），并使用自有程序筛选位于mRNA上的峰，进行相应的注释。

2.差异甲基化区域识别

云序生物使用diffReps软件进行差异修饰区域的识别。计算mRNA在不同样品组间的富集倍数变化(FC, Fold Change)和P值（注：只有每组设置3个或以上生物学重复时才能计算P值，为了结果的准确性，建议每组至少设置3个生物学重复）。根据FC和P值(默认筛选标准为P-value<=0.00001并且Fold change>=2，具体筛选阈值以实际报告为准)，筛选不同样品组间的显著性差异修饰mRNA。

3.差异甲基化基因GO分析

基因本体论（Gene Ontology，GO）计划（http://www geneontology org）为注释基因、基因产物和序列开发了一套结构化的、受控词汇表。它被分成3个部分：分子功能（Molecular Function，MF）、生物过程（Biological Process，BP）和细胞组分（Cell Component，CC）。云序生物利用差异甲基化基因进行GO功能分析，按照MF、BP、CC 3部分分别注释并推测这些差异修饰化基因可能的作用。

4.差异甲基化基因KEGG分析

KEGG 通路分析是将基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学中的分子数据集映射到KEGG通路图上，以进行这些分子的生物学功能解释的过程。云序生物利用差异修饰基因进行通路分析，以注释并推测这些差异修饰基因可能参与的通路。

5.Venn图

直观地展示不同样本中检测到的修饰峰之间的关系，圆圈中不重叠的部分代表每个样本所独有的修饰峰数量。圆圈之间重叠的部分则代表多个样本之间共有的修饰峰数量。

6.修饰区域Motif分析

通过序列信息的解析，我们可以解析生物学过程中的密码。基于Motif序列的分析，我们可以发现修饰区域并不是随机现象，而是在某些特定的碱基组合中，利用Motif分析可以挖掘其修饰或结合偏好，进而锁定相关基因的修饰或结合区域，对后续讨论、实验具有指导作用。 Motif log由每个位置的字母堆叠组成，字母是对应的碱基（ATGC）的代码，用于描述序列特征。X轴表示motif的序列长度，每个字母的高度也就是Y轴，与该位置的相应碱基的出现频率成正比，常以bits为单位。

7.Classification修饰区域分布

根据各修饰位点的坐标信息以及对应的参考基因组注释文件，将区域匹配到mRNA位置信息，将每个区域的位置与mRNA结构对应，定位到基因结构特征位置，以展示修饰位点的分布特征。

8.Metagene修饰位点甲基化密度图

根据各修饰位点的坐标信息以及对应的参考基因组注释文件，将区域匹配到mRNA位置信息，将每个区域的位置与mRNA结构对应，定位到基因结构特征位置，以展示修饰位点的分布特征。

9.修饰位点可视化

10.四象限图

（与mRNA-seq联合个性化分析内容）揭示m6A修饰变化与基因表达变化之间的关联，根据X轴和Y轴上的log2FC=1划分出的四个象限，每个象限揭示了m6A修饰变化和基因表达变化之间不同的调控模式，将那些m6A变化显著且表达变化显著的基因视为高置信度的目标基因进行后续研究。
样本要求：

样品类型：

细胞、组织、总RNA、全血，其他类型样品请电询；

样品量：

a) 细胞：≥ 5×10^6

b) 组织：≥ 100 mg

c) 总RNA：≥ 10 μg

d）全血：≥ 5 mL

样品运输及保存

样品置于1.5mL管中，封口膜封好，干冰运输。细胞样品或新鲜组织块可用TRIZOL或RNA保护剂处理，液氮冻存后-80℃保存；血液样品应使用EDTA抗凝采血管，不可用肝素抗凝管；RNA样品可溶于乙醇或RNA-free的超纯水中，-80℃保存，避免反复冻融。