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案例：使用GLORI绝对定量哺乳动物转录组中的单碱基m6A甲基化

原文：Absolute quantification of single-base m6A methylation in the mammalian transcriptome using GLORI

发表时间：2022/10/27

发表期刊：Nature Biotechnology

影响因子：41.25

发表单位：北京大学

 

 

 m6A作为高等真核生物丰富的RNA修饰类型之一，在胚胎发育、细胞分化、生物节律、疾病发生和抗逆响应等多个生物学过程中发挥关键调控功能。目前对m6A的高通量测序方法可以分为三种：

1、依赖抗体识别含有m6A的片段：m6A MeRIP-seq依赖于m6A抗体鉴定m6A修饰的RNA片段，并不能实现单碱基分辨率的m6A检测。

2、基于酶法：MAZTER-seq依赖MazF核糖核酸内切酶检测m6A位点，由于该酶只检测ACA内的m6A位点，因此具有序列偏好性，缺乏检测灵敏度。

3、化学法检测m6A：DART-seq和m6A-label-seq为m6A检测提供了新的选择，但它们仍然缺乏化学计量信息。对m6A全转录组的无偏好检测和绝对定量仍未得到解决。

2022年10月27日，北京大学王晶与伊成器课题组联合开发了单碱基m6A位点检测技术GLORI(Glyoxal and nitrite-mediated deamination of unmethylated adenosine)，首次实现了真正意义的高效率、高灵敏度、高特异性、无偏好性的m6A位点识别，并对其修饰水平进行绝对定量。GLORI的技术核心是不依赖于抗体，通过化学反应组合乙二醛和亚硝酸盐的催化体系，对未甲基化的腺苷进行高效地脱氨从而形成肌苷(A-to-I, >98%)，肌苷在测序过程中被读成鸟苷(G)，形成A-to-G的转化；而m6A测序后仍被读成A，从而实现对m6A的单碱基识别。此外，GLORI通过检测测序的读段序列中A所占的比例，实现了对单碱基m6A的绝对定量。云序生物也于2024年6月正式获得GLORI技术的授权。GLORI具有三大优势，是m6A检测的金标准。

• （一）高特异性：乙二醛和亚硝酸盐催化A-I高效转化，实现m6A修饰位点特异性识别

研究人员为了实现A的高效脱氨，通过优化NaNO2浓度、孵育温度和反应时间（图1d）以及在脱氨步骤中添加乙二醛，可实现几乎完全脱氨（>99.0%）（图1c），同时A-I转化率不受RNA中G/A比率的影响。在最佳条件下，液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）定量分析显示，实现了~99%的A-I转化率，而G-X转化率和C-U转化率分别只有~3%和~4%。重要的是，m6A在这些反应条件下不会发生脱氨反应（图1e）。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

图1. 乙二醛和亚硝酸盐介导的腺苷脱氨

 

•  （二）高检测率，高灵敏度：无偏倚单碱基定位m6A修饰，低丰度修饰m6A位点亦能精准检测

研究人员应用GLORI分析了HEK293T细胞中m6A修饰特征，发现GLORI实现了~98.0 - 99.0%的A-G转换率，只有<1.0%的G-X转换率和~3.3%的C-U转换率（图2b）。更高的测序深度可以报告更多的m6A位点，因此，研究人员对HEK293T细胞的转录组进行了深度测序（约390,000,000个唯一映射读数，或约140×覆盖率），在两个生物重复中分别检测到214,708和215,014个m6A位点，其中有176,642个共享m6A位点（约占82%），这支持了GLORI的可重复性（图2d），但在此深度下，m6A数量尚未饱和。

为了评估GLORI测定m6A的定量能力，研究人员用化学方法合成了五个含有单个m6A位点的spike-in RNA分子，甲基化水平分别为5%、20%、50%、80%和100%。即使在5%甲基化水平时，实验检测到的m6A水平与预设条件取得了极好的一致性（R=0.996）（图2e）说明GLORI可以以单碱基分辨率量化整个转录组的m6A水平。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

图2. GLORI全转录组m6A鉴定

 

• （三）高精准：无修饰文库对照，多种测序方法比较，验证GLORI在单碱基分辨率下的m6A准确定量

研究人员使用了无修饰体外转录RNA文库（IVTRNA），只发现了1856个潜在位点（相比之下，使用细胞RNA发现了约18万个修饰位点），这些位点呈现出类似非m6A分布模式，对细胞mRNA和IVTRNA检测到的位点进行比较后发现，两者的重叠几乎可以忽略不计（156个共同位点，仅占m6A位点总数的0.09%）。因此，这一新数据有力地证明了GLORI的准确性。

此外，研究人员还将GLORI的结果与SCARLET的定量m6A数据进行了比较，后者被认为是定量包括m6A在内的位点特异性修饰的黄金标准。检查了SCRALET原始论文中的23个HeLa mRNA和非编码RNA m6A位点，再次观察到两种方法之间的高度一致性（图2h），这些结果表明，GLORI能够绝对量化人类转录组中的单碱基m6A位点。

云序生物在此对目前文章中报道的测序技术的优缺点进行了归纳总结，如下表所示：

 

云序技术优势：

1.GLORI的技术核心是不依赖于抗体，通过化学反应组合筛选发现乙二醛和亚硝酸盐的催化体系，对未甲基化的腺苷进行高效地脱氨从而形成肌苷(A-to-I, > 98%)，肌苷在测序过程中被读成鸟苷(G)，形成A-to-G的转化；而m6A测序后仍被读成A，从而实现对m6A的单碱基识别。GLORI通过检测测序的读段序列中A所占的比例，实现了对单碱基m6A的检测。

2.GLORI-seq由北京大学王晶与伊成器课题组联合开发，首次实现了真正意义的高效率、高灵敏度、高特异性、无偏好性的m6A位点识别，并在文库准备过程中引入了唯一分子识别符(UMI)序列，消除逆转录过程中由扩增效率引起的偏差，实现m6A的绝对定量。云序生物也于2024年6月正式获得GLORI技术的授权。

3、尽管当下已经开发了多种m6A检测和测序方法，但是GLORI的技术相较于基于m6A抗体的检测方法，能够得到单碱基检测。相较于基于限制性内切酶的检测技术（只能检测含有ACA 基序的m6A）实现对m6A修饰位点的99.9%的检测，范围更广。

 

数据分析（仅供展示 详见demo报告）

一、分析内容

1.原始数据整理，低质量reads过滤，数据质控

2.m6A修饰位点的识别

3.差异m6A修饰位点的识别

4.差异修饰基因GO富集分析

5.差异修饰基因KEGG通路分析

6.Motif分析

7.Venn韦恩图

8.Classifiaction分布

9.Metagene分析

 

二、部分数据分析结果示例

1.m6A修饰位点的识别

使用GLORI-tools软件识别出每个样本中的m6A修饰位点，再通过自有程序挑选出与已知编码基因的exon重叠的m6A修饰位点。识别的修饰位点结果如下表。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2.差异修饰基因GO富集分析

基因本体论（Gene Ontology，GO）计划（http://www geneontology org）为注释基因、基因产物和序列开发了一套结构化的、受控词汇表。它被分成3个部分：分子功能（Molecular Function，MF）、生物过程（Biological Process，BP）和细胞组分（Cell Component，CC）。云序生物利用差异甲基化基因进行GO功能分析，按照MF、BP、CC 3部分分别注释并推测这些差异修饰化基因可能的作用。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3.差异修饰基因KEGG通路分析

KEGG 、PATHWAY是将基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学中的分子数据集映射到KEGG通路图上，以进行这些分子的生物学功能解释的过程。云序生物利用差异修饰基因进行通路分析，以注释并推测这些差异修饰基因可能参与的通路。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

4.Motif分析

通过序列信息的解析，我们可以解析生物学过程中的密码。基于Motif序列的分析，我们可以发现修饰区域并不是随机现象，而是在某些特定的碱基组合中，利用Motif分析可以挖掘其修饰或结合偏好，进而锁定相关基因的修饰或结合区域，对后续讨论、实验具有指导作用。 Motif log由每个位置的字母堆叠组成，字母是对应的碱基（ATGC）的代码，用于描述序列特征。X轴表示motif的序列长度，每个字母的高度也就是Y轴，与该位置的相应碱基的出现频率成正比，常以bits为单位。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

5.Classification分布

根据各修饰位点的坐标信息以及对应的参考基因组注释文件，将区域匹配到mRNA位置信息，将每个区域的位置与mRNA结构对应，定位到基因结构特征位置，以展示修饰位点的分布特征。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

6.Metagene分析

展示不同样本在不同基因区（5’UTR，CDS，3’UTR）的修饰程度对比情况，X轴代表基因位置信息，Y轴代表识别的修饰位点密度高低。

 

样本要求：

样品类型：细胞、组织、体液或RNA样品。其它类型样品请详询。

样品量：

a)细胞：≥ 5×10^6

b)组织：≥ 100mg

c)全血：≥ 5mL

d)总RNA：≥ 10μg

样品运输及保存

样品置于1.5mL管中，封口膜封好，干冰运输。 细胞样品或新鲜组织块可用TRIZOL或RNA保护剂处理，液氮冻存后-80℃保存；

血液样品应使用EDTA抗凝采血管，不可用肝素抗凝管；RNA样品可溶于乙醇或RNA-free的超纯水中，-80℃保存，避免反复冻融。