cfMethFrag测序技术

 

 

cfMethFrag-Seq产品列表

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

技术简介：

 

一、cfDNA 携带的双重信息

循环游离DNA（cfDNA）在血液中并非随机存在的降解片段。cfDNA携带的DNA序列、核小体定位、组蛋白修饰状态及片段物理特征，共同反映了来源细胞的染色质状态、基因调控活动及细胞死亡过程，为无创液体活检提供了丰富的多维分子信息。

DNA甲基化信息：DNA甲基化修饰在基因表达调控、基因组稳定性维持中发挥核心作用。cfDNA中的甲基化模式可反映来源细胞的表观遗传状态，已成为癌症早筛、微小残留病灶（MRD）监测、器官移植排斥评估等场景的重要生物标志物。

片段组学信息：cfDNA的片段长度、片段大小比例、末端碱基基序、断裂位点偏好、核小体足迹及全基因组覆盖度等物理特征，同样携带来源组织的染色质结构信息。2021年，卢煜明团队在《Science》发表综述，将片段组学确立为与基因组学、表观基因组学并列的独立研究维度。

 

二、cfMethFrag-Seq测序技术

长期以来，cfDNA的甲基化组学与片段组学数据往往由不同研究团队独立生成，需要分别消耗样本、分别建库测序，不仅样本用量大、成本高，且缺乏大规模、标准化处理且同时整合两类信息的泛癌种数据资源，难以进行统一的比较与深入挖掘。对于血浆cfDNA这类起始量极低的珍贵样本而言，如何在有限样本量下同时获取多维分子信息，成为液体活检领域的重要挑战。

基于上述需求，云序生物正式推出cfMethFrag-Seq测序技术服务。该技术在同一份cfDNA样本上并行构建两个文库：

甲基化文库：基于微量样品的甲基化抗体富集技术，通过特异性抗体高效富集甲基化cfDNA片段，结合高通量测序，实现全基因组范围内甲基化富集区域的精准检测，在癌症早筛与分子分型中展现出极高的灵敏度；

片段组学文库：对cfDNA直接建库测序，完整保留cfDNA的原始片段特征，用于片段长度分布、末端碱基偏好、核小体足迹等片段组学特征分析。 cfMethFrag-Seq在不增加样本消耗的前提下，通过一次建库测序，同步输出DNA甲基化图谱与cfDNA片段组学特征，真正实现"一次测序，两份数据"，为液体活检提供多维度分子证据。

 

技术优势

1. 一次测序，两类数据，同源配对分析

同一份cfDNA样品建库后分别获得IP和Input文库，分别用于甲基化和片段组学分析。两类数据来源于同一份原始cfDNA，不仅节省样本，还可减少个体差异及独立采样、重复提取带来的偏差，使甲基化信号与片段特征能够直接对应和比较。

2. 具备Input背景对照，校正个体间差异

与EM-seq、WGBS等基于碱基转化的甲基化测序不同，cfMethFrag-Seq采用免疫富集策略，并保留同一样本的Input文库作为背景参照，可有效扣除拷贝数变异、染色质可及性、GC含量偏好以及测序覆盖不均等系统性因素带来的干扰，使得不同个体之间的甲基化富集信号具有更好的可比性。

3. Input文库完整保留cfDNA原始物理特征

片段组学分析依赖于cfDNA末端序列与长度分布的真实信息。cfMethFrag-Seq中的Input文库不经过免疫沉淀，也不经过任何碱基转化处理，直接由天然cfDNA建库测序，最大程度保留了片段长度、末端基序及核小体足迹等原始物理特征，为片段组学分析提供了更为可靠的数据基础。

4. 可定向提取甲基化片段，开展靶向片段组学分析

IP文库富集了携带甲基化修饰的cfDNA片段，可针对这部分片段单独进行长度分布、末端基序等分析，而不局限于全基因组cfDNA的整体平均特征。由此可将甲基化状态与片段物理特征直接关联，挖掘单一组学难以获得的疾病特征。

 

技术原理

提取后的cfDNA分为两部分：一部分使用甲基化抗体进行免疫沉淀富集（IP文库），用于全基因组甲基化分析；另一部分未经富集直接保留作为Input文库，用于cfDNA片段组学分析。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

cfMethFrag-Seq流程图

 

相关产品

1、5mC cfDNA/ctDNA甲基化测序技术

云序生物较早推出cfDNA/ctDNA甲基化测序服务，低仅需20ng cfDNA/ctDNA既可进行测序。客户仅需提供血浆，血清或体液样本，云序生物为完成从cfDNA/ctDNA提取，文库制备，上机测序到数据分析整套服务流程。

2、cfDNA片段组学测序

云序生物cfDNA片段组学测序技术，通过全基因组测序（WGS）结合高灵敏度建库策略，在无需靶向富集、无需化学修饰处理的前提下，直接解析cfDNA的片段长度分布、末端碱基基序及核小体足迹等多维物理特征信息。该技术在保留全基因组无偏分析优势的同时，实现对疾病相关片段化异常信号的精准识别，为肿瘤早筛、组织溯源、疗效监测及多种无创液体活检研究提供高灵敏度、高可解释性的科研解决方案。

3.超微量cfDNA ChIP测序技术

云序生物超微量cfDNA ChIP测序技术，通过针对特定组蛋白修饰的抗体富集血浆中的循环核小体复合物，并结合高灵敏度单链DNA（ssDNA）建库策略，实现对超低输入、超短及部分受损cfDNA分子的高效捕获与检测，在降低背景噪音的同时显著提升低丰度cfDNA的利用效率，从而实现对cfDNA表观遗传修饰信息的精准解析，为用户提供基于cfDNA的无创表观液体活检研究方案，助力疾病机制研究与科研转化应用。

4.单碱基cfDNA/ctDNA甲基化测序（EM-seq法）

EM-seq结合使用多种酶，在保证5mC（或羟甲基化的5hmC）在测序中仍被识别为C的前提条件下，进行单碱基分辨率级别的修饰位点识别。EM-seq 有效弥补了重亚硫酸盐法测序（Bis-seq）的强化学处理可能会降解DNA的缺陷，可以广泛应用于包含 cfDNA/ctDNA 在内的微量脆弱DNA 样品。

5.Genseq® 游离核酸试剂盒

云序生物Genseq®游离核酸试剂盒，致力于打造高性能、低成本且供应稳定的国产替代方案。一次操作即可同时高效提取cfDNA与cfRNA，所得高质量核酸可直接用于Northern杂交、cDNA文库构建、PCR、酶切、qPCR、RT-PCR等常规分子生物学实验。

 

数据分析（仅供展示 详见demo报告）

一、分析项目

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

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二、部分数据分析结果示例

1. cfDNA甲基化分析

1)功能区分布分析

云序生物根据参考基因组注释文件，将基因组划分区域，再根据peak的坐标信息，将peak匹配到最近的基因组区域，统计各区域的peak所占比例，能够展示修饰的基因组功能区域分布特征。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2)染色体分布分析

云序生物利用修饰峰的坐标信息，统计各峰在参考基因组中各条染色体上的具体位置，绘制染色体分布图。使用颜色深度来可视化peak的分布密度，颜色越深的区域表示该染色体位置上的修饰峰数目越多。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3)长度分布分析

健康个体血浆cfDNA通常以约167 bp的单核小体片段为主要峰值，并可见约320–340 bp左右的双核小体相关片段及其他较长片段。实际片段分布会受到疾病状态、样本前处理、建库方法和测序策略影响。然而，根据初始血液样本的储存和处理方式，分离出的cfDNA可能含有来自储存或处理过程中裂解白细胞的大片段（>1 kb）基因组DNA，影响最终测序文库的产量并削弱cfDNA信号强度。通过观察检测到的片段长度分布曲线，能有效评估样本质量是否符合预期。

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2. cfDNA片段组学分析

1)片段大小比（Fragment Size Ratio，FSR）

FSR将短片段、中间片段和长片段分别定义为65-150bp、151-220bp和221-400bp，用于评估不同长度cfDNA片段之间的相对比例，反映cfDNA整体片段化程度。由于肿瘤来源cfDNA通常表现出更高比例的短片段，FSR能够敏感捕捉肿瘤相关的片段长度偏移，是反映cfDNA片段化特征的重要指标之一。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2)拷贝数改变（CNA）分析

肿瘤细胞在发生和进展过程中，常伴随染色体扩增、缺失、非整倍体及其他结构性基因组异常，释放到血浆中的cfDNA会携带这些基因组拷贝数特征。基于cfDNA片段组学测序，可通过全基因组覆盖度归一化分析构建血浆DNA拷贝数谱。连续的覆盖度升高或降低分别对应染色体区域的拷贝数增益或缺失，从而评估肿瘤相关的染色体不稳定性、大片段CNA及样本间基因组差异。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3)末端motif（EDM）分析

EDM分析cfDNA片段5'末端四个碱基的序列组成。由于不同核酸酶活性、染色质可及性及细胞死亡方式会产生特征性的切割模式，EDM能够揭示cfDNA形成机制及组织来源差异，是近年来cfDNA片段组学研究的重要特征。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

4)核小体足迹分析

cfDNA核小体足迹分析基于cfDNA片段保留的核小体定位特征。基于TSS附近的片段覆盖度和核小体定位模式，可间接推断相关区域的染色质开放状态及基因转录活性，并为肿瘤早期筛查、组织溯源及疾病动态监测提供高分辨率的表观遗传学信息。