cfDNA片段组学技术

技术简介

一、什么是cfDNA片段组学

 循环游离DNA（cfDNA）并非血液中随机降解的DNA碎片。由于cfDNA在体内释放时受到核小体的严密保护，其断裂过程并非随机，而是受到染色质开放状态、核小体结合情况以及内切酶切割偏好的精细调控。当细胞发生凋亡或坏死时，释放进入血液的cfDNA精确保留了来源细胞核内的染色质结构信息与表观遗传特征。

cfDNA片段组学（cfDNA Fragmentomics）正是基于这一物理规律，通过对血液cfDNA进行深度的物理特征挖掘，解析染色质的开放与闭合状态，从而在基因序列变异（SNV）之外，提供更为宏观、直观的疾病分子全景。研究者们通过几项奠基性发现，系统化确立了片段组学的三大核心分析维度：

片段长度分布（Size Distribution）：正常造血细胞释放的cfDNA主峰在167bp左右（单核小体长度），而肿瘤细胞由于异常的坏死和凋亡机制，会释放大量更短的片段。

末端碱基模式（End Motif）：cfDNA断裂末端并非平齐，切割酶切位置具有特异性，不同组织来源的染色体片段末端偏好不同。特定的末端序列偏好与方向性特征能够反映组织来源，为片段组学增加了末端序列这一全新维度。

核小体足迹（Nucleosome Footprinting）：WGS测序在基因组上的覆盖度并非均匀，而是呈现约180bp的周期性波动。 这三大特征的发现，标志着cfDNA研究正式向片段组学这一独立方向演进。

图1 cfDNA的生物学特征

二、cfDNA片段组学的临床应用进展

在奠基性发现之后，该领域迅速向临床应用转化。早期的高价值应用证明了单一cfDNA物理特征即具备强大的疾病识别能力：

在片段长度的直接诊断应用方面，Underhill HR等人（Underhill et al., 2016）在《PLoS Genetics》的研究表明，仅利用短片段比例（如100-150bp区间占比）这一单一指标，无需构建预测模型，即可显著区分早晚期癌症患者与健康人。Mouliere F等人（Mouliere et al., 2018）在《Science Translational Medicine》进一步拓展了片段长度的应用边界，指出超短片段（<100bp）和超长片段（>250bp）在癌症患者血浆中存在富集现象，纯比例分析即可大幅提升ctDNA的检测敏感性。

在末端基序的应用方面，Jiang P等人（Jiang et al., 2020）在《Cancer Discovery》发表研究，系统性地建立了血浆DNA末端基序图谱，证明该特征可作为一种片段组学标志物（Fragmentomic Marker），在癌症、妊娠及器官移植等多种生理与病理状态中展现出显著的区分能力。

这些研究确立了cfDNA片段组学各单一特征的独立价值与生物学可解释性。

图2 cfDNA片段组学的临床应用

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随着领域的不断成熟，近年来的研究趋势逐渐从单一特征验证迈向多维特征整合。2019年，Cristiano S等人（Cristiano et al., 2019）在《Nature》提出DELFI（DNA Evaluation of Fragments for Early Interception）方法，基于低深度WGS系统性地提取全基因组片段化谱，在七种癌症类型中实现了高灵敏度的早期检测。

2021年，卢煜明（Dennis Lo）团队在《Science》发表重要综述（Lo et al., 2021），将片段长度、末端基序、核小体足迹等多维片段组学特征与表观遗传信息进行系统整合，正式将这一研究方向定义为cfDNA片段组学（cfDNA Fragmentomics），使其上升为与基因组学（Genomics）、表观基因组学（Epigenomics）并列的独立组学层次，表明cfDNA片段组学具有广阔的研究和临床应用价值。

紧跟科研热点，云序生物倾力打造cfDNA片段组学测序前沿平台。服务聚焦于片段长度、末端基序及核小体印记等核心研究维度，精准捕捉cfDNA的“分子指纹”。我们不仅提供深度数据挖掘，更旨在赋能临床转化，助力片段组学从实验室研究走向精准诊疗的广阔舞台。

技术优势

1.无创可重复采样，超低样本起始量，显著降低检测门槛

仅需低至5 ng cfDNA即可稳定获得全基因组片段化谱，大幅减少样本依赖测序成本，尤其适合早期肿瘤、微量采血、动态监测及大规模人群筛查场景。

2.无需富集，直接实现无偏全基因组位置特异性分析

通过标准双端测序精确测定片段长度，在基因组窗口内统计短/长片段比例与分布，即可捕获位置特异性异常。不依赖基因panel或抗体富集，对低丰度肿瘤来源cfDNA仍保持高灵敏度。

3.天然反映核小体定位与染色质结构，无需额外表观实验

健康cfDNA片段化模式高度吻合核小体保护位点与染色质开闭状态；疾病状态下则呈现全基因组紊乱。直接从游离DNA片段长度与末端分布读取染色质可及性信息，省去了传统 ChIP 或核小体测序的繁琐步骤。

技术原理

cfDNA片段组学通过对血浆cfDNA进行全基因组测序（WGS），在不进行任何靶向捕获或化学修饰处理的前提下，直接从测序数据中提取多维物理特征信息。

实验流程如下：

cfDNA提取和质控：利用Genseq® 游离核酸试剂盒提取cfDNA，并使用Bioanalyzer 2100评估质量。

cfDNA变性及单链化：将质控合格的cfDNA与单链化缓冲液混合进行温和变性，使双链cfDNA解链形成单链DNA（ssDNA）。

接头连接：在单链DNA连接酶及缓冲体系中，接头通过末端保留方式连接至ssDNA原生末端，不引入额外的末端填补或加 A 尾步骤，从而保留 cfDNA 原始断裂特征。

双链文库中间体形成：为获得可扩增的双链文库，以连接产物为模板，使用与接头及 cfDNA 末端互补的引物进行温和引物延伸反应。

低循环PCR 扩增：采用高保真DNA聚合酶对文库中间体进行低循环数PCR扩增，以引入完整测序接头并放大文库信号。

纯化与测序：PCR 产物经磁珠纯化去除引物二聚体及游离接头，使用 Qubit 对文库浓度与片段大小进行质控。质控合格后进行双端测序。

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