糖基化RNA定量PCR服务

 

 

 

技术简介：

 

糖基化RNA（GlycoRNA）作为一类新发现的被聚糖修饰的RNA分子，正在成为连接糖生物学与RNA生物学的前沿研究领域。其检测与定量分析需要兼具高灵敏度、高特异性和精准定量能力的技术。GlycoRNA-seq是一项创新的测序技术，揭示了GlycoRNA在不同物种、组织和细胞类型中的表达模式、功能差异以及修饰特征，帮助我们更好地理解glycoRNA的生物学功能。但高通量测序数据量较大，分析识别过程可能会存在一定噪声和误差，或者存在一些非特异性信号，因此，我们还需要进行低通量验证实验，确保实验数据的真实性，这正是glycoRNA研究领域所缺失的。

 

针对这一领域空白，云序生物推出糖基化RNA定量验证服务（glycoRNA-qPCR）。作为糖基化RNA验证的金标准技术，glycoRNA-qPCR通过高碘酸盐氧化和醛连接法（rPAL）标记结合实时荧光定量PCR（qPCR），实现不同生物背景下glycoRNA的特异性富集与实时定量分析，精准验证糖基化RNA候选分子。

云序生物glycoRNA-qPCR服务流程：

1.RNA优化的高碘酸盐氧化和醛连接法（rPAL）标记glycoRNA：

1)RNA纯化：使用高浓度蛋白酶K消化提取后的RNA样本中的蛋白质，随后通过硅胶柱纯化RNA。为去除可能残留的DNA污染，加入无RNase的DNase进行处理，确保RNA样本的纯度。

2)高碘酸盐氧化：在温和高碘酸氧化条件下 (7.5mM NaIO4, 10 分钟，室温)对RNA中的糖基化部分进行选择性氧化，与GlycoRNA上唾液酸中的邻二醇发生特异性反应，将唾液酸二醇氧化为醛基。

3)醛连接反应：将氧化后的醛基与含有胺基的生物素标记试剂进行连接反应，从而实现GlycoRNA的特异性标记。

4)富集与洗涤：使用链霉亲和素磁珠（Streptavidin beads）对生物素标记的GlycoRNA进行富集。通过强力洗涤步骤去除未结合的非糖基化RNA及其他杂质。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

rPAL法标记唾液酸糖基

 

 

2.qPCR：

rPAL标记的主要实验偏差之一是生物素探针与某些RNA的非特异性结合。为了解决这个问题，云序生物使用未进行rPAL标记的样品（非标记组）作为阴性对照，进行相同的实验处理。由此确定转录本的背景富集水平，然后将rPAL标记RNA的糖基化丰度除以背景糖基化丰度来计算实验组中靶转录本的实际富集倍数。这种方法有效地排除了rPAL标记和链霉亲和素珠富集过程中产生的非特异性信号。

      将每个样品分为4组：

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

根据选定的基因上预测的糖基化区域设计引物，分别对不同组的IP和Input组的RNA反转录后进行qPCR。通过2^ΔΔCt计算得到Fold Enrichment，从而量化某基因区域的糖基化丰度，便于进行组间的比较。

 

3.GlycoRNA-qPCR结果的计算：

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1)rPAL标记组：ΔCt[normalized ENRICH]=Ct rA1-(Ct rA2-Log2(Input Dilution Factor))

非标记组：ΔCt[normalized ENRICH]=Ct A1-(Ct A2-Log2(Input Dilution Factor))

2)ΔΔCt[glycoRNA]=ΔCt[normalized ENRICH rPAL标记组]-ΔCt[normalized ENRICH非标记组]

3)Fold Enrichment=2^(-ΔΔCt [glycoRNA])

 

*其中Ct是qPCR得到的循环数，Dilution Factor是稀释倍数。如最初用于IP和Input的RNA总量的比例为a：b，则Dilution Factor=b/a（经过IP实验得到的RNA量一定少于不做IP实验的Input的RNA量，且qPCR的使用的IP和Input的模板量也不同，因此要在计算的时候将差异倍数考虑进去）。 *注：只有每组设置3个或以上生物学重复时才能计算P值，为了结果的准确性，建议每组至少设置3个生物学重复

 

  产品优势：

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

样本要求：

样品类型： 细胞、组织、血液或总RNA，其他样本类型请电询。

样品量：

a.细胞：1×10^7

b.组织：>200mg

c.血液：全血>20ml（推荐用EDTA抗凝采血管，不可用肝素抗凝管）

d.总RNA：>25μg（RIN≥6）

样品运输及保存：

样品运输：样品置于1.5mL离心管中，封口膜封好，干冰运输。

样品保存：细胞样品或新鲜组织块可用TRIzol或RNA保护剂处理，液氮冻存后-80℃保存;血液样品应使用EDTA抗凝，不可用肝素；RNA样品可溶于乙醇或RNA-free的超纯水中，-80C保存，避免反复冻融。

 

高分文章案例

 

案例：长链糖基化RNA的发现与Clier-qPCR验证技术

 

原文：Transcriptome-wide Identification of GlycoRNAs by Clier-seq Pipeline

 

期刊：BioRxiv预印本

 

糖基化RNA（glycoRNA）是一类在RNA分子上共价连接N-糖链的新型修饰形式，主要存在于细胞表面，参与细胞间通讯、免疫调控和疾病发展。此前研究主要聚焦于<200 nt的小RNA（如tRNA、Y RNA等），但更长RNA（如lncRNA）的糖基化修饰尚未系统研究。 研究团队开发了Clier-seq（Click化学富集糖基化RNA测序）和Clier-qPCR技术，用于全转录组范围的糖基化RNA鉴定与验证。高通量Clier-seq分析在P3HR1、Akata和CNE2细胞系中鉴定了几种未注释的长非编码RNA（lncRNA），包括MSTRG.7832、MSTRG.5930和MSTRG.18836。将用Ac4ManNAz（Ac4+）标记的细胞与未标记的对照（Ac4-）进行比较。Ac4+组中的这些RNA的浓度增加了200倍以上，Ac4−对照组中的信号最小。例如，P3HR1细胞中的MSTRG.7832表现出250±15倍的富集。除此之外，该研究还发现了新型糖基化RNA：Vault RNA（vtRNA2-1）。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Clier-seq工作流程

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

GlycoRNA-qPCR作图示例