环状DNA Sanger测序验证技术

 

 

 

技术简介：

 

游离于染色体基因组之外的DNA (extrachromosomal DNA，ecDNA)被发现常常以环状的形式存在，这种形式的DNA被称为环状DNA (extrachromosomal circular DNA，eccDNA）。目前也习惯将巨大的环状DNA(>1Mb)称为ecDNA, 而将相对较小的环状DNA称为eccDNA。 传统观点认为真核基因组通常形成稳定的线性染色体。但最新的研究表明：无论是在正常体细胞还是癌细胞中，都存在大量染色体外环状DNA。2019年，Nature杂志上发表了颠覆性研究成果：在肿瘤中，主要的癌基因转录本是直接来自于环状DNA的，而环状DNA的染色质是高度开放的，环状DNA的癌基因能够大量表达，同时缺乏着丝粒，导致不遵照孟德尔定律进行遗传，这种特性使得环状DNA是驱动肿瘤异质性的重要机制。由此可见，由于其结构和表达的特异性，环状DNA可以影响细胞生命活动，促进肿瘤细胞演进和适应性进化，增加了基因组的可塑性和不稳定性。目前，环状DNA不仅仅可以作为一种新型特异的肿瘤标志物，还在肿瘤发生发展机理研究中发挥着重大的潜在价值。可以预见的是，环状DNA将迅速成为新的科研热点，甚至会对传统遗传学和基因组学带来影响。

 

 

针对测序项目中筛选出的环状DNA，云序提供sanger测序服务验证环状结构。通过设计反向引物进行PCR扩增，验证连接位点处序列。通过反式PCR扩增出来的产物，将覆盖环状DNA连接位点的扩增产物进行sanger测序，精确证实连接位点。通过sanger低通量测序，一方面更加严谨地核实了所挑选出的环状的连接位点，第二方面验证了高通量测序和分析识别环状DNA的准确性，第三方面可以确认某些高通量测到表达量较低的环状确实存在。

 

云序生物针对环状DNA的break point设计反向引物

 

 

实验方法

 

1. PCR 扩增
2. 琼脂糖电泳及胶回收
3. Sanger 测序及结果分析

 

数据分析（仅供展示  详见demo报告）

1. 环状DNA特异性的junction位点分析

 

云序用户案例

案例：血清eccDNA SORBS1circ水平升高与新诊断的 2 型糖尿病患者的胰岛素抵抗有关

原文：Increased serum extrachromosomal circular DNA SORBS1circle level is associated with insulin resistance in patients with newly diagnosed type 2 diabetes mellitus

期刊：Cellular & Molecular Biology Letters   影响因子：9.2   发表时间：2024/1

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

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2 型糖尿病(T2DM)是一种严重、复杂的慢性疾病其特征是高血糖和胰岛素抵抗。与正常对照(NC)受试者相比，T2DM 患者血清或血浆中游离 DNA 和线粒体 DNA 浓度的显著变化已被证实。然而，目前缺乏关于 T2DM 患者 eccDNA的已发表数据。 在本研究中对新诊断的 T2DM 患者和 NC 受试者的血清 eccDNA 进行了表征，并将SORBS1circle的 SH3结构域确定为一种新的 eccDNA。通过eccDNA-qPCR和对PCR产物的eccDNA sanger测序，SORBS1circle已被验证为T2DM 患者血清中上调最显著eccDNA。此外，我们确定了eccDNA SORBS1circle在新诊断的 T2DM 患者队列中的临床价值，发现eccDNA SORBS1circle的增加与胰岛素抵抗相关。最后，我们已经证明，由凋亡 DNA 片段化产生的 eccDNA SORBS1circle在高葡萄和棕榈酸酯(HG/PA)诱导的 HepG2细胞胰岛素抵抗模型中显著增强。

 

 

 

 

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样本要求：

 

样品类型：
组织、细胞、血清血浆或DNA样品。

样品量：
a）细胞：2×10^7
b）组织：200mg
c）血清血浆：5mL
d）DNA：>=10 µg，溶于无菌水或 TE（PH = 8）（OD 260/280值应在1.7～2.0 之间；RNA 应该去除干净；不得有其它个体或其它物种的DNA污染）。

样品运输及保存：
样品运输：样品置于1.5mL Eppendorf管中，封口膜封好，干冰运输，DNA可用冰袋运输。
样品保存：细胞样品或新鲜组织块切块，液氮冻存后-80℃保存；DNA样品短期内可-20℃，避免反复冻融。