环状DNA PCR验证技术

 

环状DNA简介

游离于染色体基因组之外的DNA (extrachromosomal DNA，ecDNA)被发现常常以环状的形式存在，这种形式的DNA被称为环状DNA (extrachromosomal circular DNA，eccDNA）。目前也习惯将巨大的环状DNA(>1Mb)称为ecDNA, 而将相对较小的环状DNA称为eccDNA。

传统观点认为真核基因组通常形成稳定的线性染色体。但新的研究表明：无论是在正常体细胞还是癌细胞中，都存在大量染色体外环状DNA。2019年，Nature杂志上发表了颠覆性研究成果：在肿瘤中，主要的癌基因转录本是直接来自于环状DNA的，而环状DNA的染色质是高度开放的，环状DNA的癌基因能够大量表达，同时缺乏着丝粒，导致不遵照孟德尔定律进行遗传，这种特性使得环状DNA是驱动肿瘤异质性的重要机制。由此可见，由于其结构和表达的特异性，环状DNA可以影响细胞生命活动，促进肿瘤细胞演进和适应性进化，增加了基因组的可塑性和不稳定性。目前，环状DNA不仅仅可以作为一种新型特异的肿瘤标志物，还在肿瘤发生发展机理研究中发挥着重大的潜在价值。可以预见的是，环状DNA将迅速成为新的科研热点，甚至会对传统遗传学和基因组学带来革命性影响。

 

相关产品

Circle-Seq：

可先通过Circle-seq筛选差异表达的环状DNA，再用PCR验证其在样本中的表达趋势，形成“测序发现-PCR验证”的完整流程。

环状DNA Sanger测序验证：

对PCR产物进行低通量的Sanger测序可以确认某些高通量测序测到表达量较低的环状结构确实存在，也能够验证高通量测序和分析识别环状DNA的准确性。

eccDNA定量PCR：

二者联合能够确定环状DNA存在的同时进行精确定量，更好地验证环状DNA。

 

 

环状DNA PCR验证服务

研究环状DNA的过程中，我们会使用高通量测序初步筛选功能性环状DNA，之后还需要进行一些对应的低通量验证实验才能更好地确保实验数据的真实性。云序生物提供环状DNA PCR验证服务，采用outward和inward两种方式进行引物设计（eccDNA引物设计教程），并进行相应的outward PCR和inward PCR，然后将PCR产物跑胶，观察胶图结果。 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

中间产物电泳引物设计原理示意图

 

 

inward扩增引物不包含junction位点，在基因组DNA和eccDNA中均能扩增出产物；而outward扩增引物包含junction位点，在基因组中扩增出的产物不唯一，所以胶图条带是弥散的，而在富集后的eccDNA中能扩增出大量的eccDNA，所以条带较清晰明亮。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

中间产物电泳鉴定结果图

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

样本要求：

样品类型：

 组织、细胞、血清血浆或DNA样品，其他类型请详询。

样品量：

a）细胞：≥1×10^7

b）组织：≥200mg

c）血清血浆：≥5mL

d）DNA：≥10µg（OD260/280值应在1.7～2.0之间；RNA应该去除干净；不得有其它个体或物种的DNA污染）。

样品运输及保存：

样品运输：样品置于1.5mL Eppendorf管中，封口膜封好，干冰运输，DNA可用冰袋运输。

样品保存：细胞样品或新鲜组织块切块，液氮冻存后-80℃保存；DNA样品可在-20℃短期保存或-80℃长期保存，保存期间避免反复冻融。