蛋白组学
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修饰蛋白质组分析

生物体中许多至关重要的生命进程不仅由蛋白质的相关丰度控制,还会被各种时空特意分布、可逆的翻译后修饰调控,因此揭示翻译后修饰的发生规律是解析蛋白质复杂多样的生物功能的一个重要前提。

蛋白质发生翻译后修饰时其分子质量会发生相应的改变,通过质谱能够精确测定蛋白质或多肽的分子质量。同时,发生翻译后修饰的蛋白质在样本中含量低且动态范围广,所以在质谱检测前需要对发生修饰的蛋白质或肽段进行富集。

蛋白质磷酸化位点分析:

蛋白样品中,发生磷酸化的蛋白质和肽段含量极低,且存在各种非磷酸化肽段和无机盐的干扰,致使检测磷酸化蛋白和磷肽段非常困难。因此,发展新型的富集方法和富集材料对磷酸化蛋白和肽段进行快速、准确地分析具有十分重要意义。

常用的磷酸化肽富集方法有固定金属离子亲和色谱法(immobilized metal affinity chromatography, IMAC)、强阴阳离子交换色谱法、免疫法和金属氧化物富集法等。

在众多的金属氧化物中,TiO2是最常用、发展最成熟的一种。在酸性条件下,TiO2表面带正电,可以与磷酸化肽发生静电作用而达到吸附的目的。

样品经酶解后,用TiO2微球对磷酸化肽段进行富集,富集后的产物由高精度质谱分析,并通过专业软件完成数据检索。

单蛋白修饰位点鉴定:

单个蛋白磷酸化鉴定是指对经过分离纯化、纯度较高的目标蛋白质(目标蛋白质纯度>80%)进行ESI质谱鉴定,获得磷酸化位点、肽段以及蛋白信息。对蛋白样本进行酶解,微量富集磷酸化肽段(可选),LC-MS/MS检测,利用得到的质谱图与相应数据库搜索比较,从而得到相关结果。

技术路线:




高纯度:

为降低非目标蛋白的干扰,目的蛋白纯度须高至80%以上。

分辨率高 

精确鉴定蛋白磷酸化位点,可定位到单个氨基酸位点的磷酸化修饰。

多种碎裂模式选择:

可提供CID、ETD或者HCD等多种碎裂模式,提到蛋白鉴定率。

样本量需求较高:

利用TiO2富集磷酸化肽段,相对于非修饰蛋白质组学研究,蛋白样本消耗高。

案例:鉴定经胰岛素抑制或激活的蛋白磷酸酶1调节亚基12A的特异性磷酸化位点(PPP1R12A

研究内容:

蛋白磷酸酶1(PP1)是负责蛋白脱磷酸化的主要磷酸酶之一。迄今为止,仅少数特异的蛋白磷酸酶1调节亚基12A(PPP1R12A)的磷酸化位点被发现有调控PP1的活性。有研究发现PPP1R12A与胰岛素刺激存在关系,但胰岛素对PPP1R12A的具体影响基本上不了解。本次研究通过LC-MS/MS技术鉴定并定量了经胰岛素刺激的CHO/IR 细胞模型中的PPP1R12A磷酸化位点,经信息分析认为PPP1R12A发生磷酸化对胰岛素信号转导可能有一点作用。

研究路线:

样本:CHO/IR 细胞,分为胰岛素处理和非处理组,经免提沉淀得到蛋白样本

技术:直接LC-MS/MS分析,没有经过富集

研究结果:

共鉴定到21个磷酸化位点,其中有7个位点属于首次发现。胰岛素刺激PPP1R12A磷酸化,主要发生在Ser477、Ser478、Ser507、Ser668和Ser695位点,而Ser509位点明显受到抑制。说明PPP1R12A磷酸化在胰岛素信号转导过程中可能发挥作用。

本次研究中新发现的磷酸化位点可以作为胰岛素活性中PPP1R12A和PPP1R12A-PP1cδ复合物调控作用,以及其它信号通路的研究靶标。


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