蛋白组学
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蛋白质组绝对定量分析

蛋白质组绝对定量分析

是目前基于质谱的绝对定量蛋白质组学,研究主要是指靶向蛋白质学。靶向蛋白质组学分析,是指对目标蛋白质(或修饰肽段)进行定性和/或定量分析,或者用于验证大规模蛋白质组学的结果。基于质谱的靶向蛋白质组学分析方法,由于没有物种限制并具备多目标同时分析能力等优势,在相关研究领域已逐渐受到越来越多的关注和应用。其技术方法经历了从传统的SRM/MRM(选择性/多反应监视,selected / multiple reaction monitoring)到PRM(平行反应监视,parallel reaction monitoring)的发展历程。

生物质谱多反应监测技术(MRM

生物质谱多反应监测技术(MRM)是目前最灵敏的质谱检测模式,被认为是质谱的“金标准”。 MRM 技术相比 EILSA,优点在于高通量,开发成本相对较低,稳定性高,不受抗体批次影响,方法一旦开发成功,可以广泛推广到各个实验室及临床检测,但在灵敏度上稍有不足。 为此, 我们可以通过控制仪器状态,优化参数,以及特殊样品处理方法如加入一维分离或者亲和富集,来提高检测灵敏度,开发出高灵敏,高特异,高通量的疾病标志蛋白检测方法。

MRM/SRM技术是一种基于已知或假定的反应离子信息,有针对性地选择数据进行质谱信号采集,该方法首先检测到具有特异性的母离子,然后只将选定的特异子离子进行质谱信号的采集。最终,通过合成同位素形成的目标肽段,将已知浓度的内标肽与待测样品混合,选择特定母子离子对获得不同的色谱检出信号,比较两者的信号强度值,实现目的蛋白质的绝对定量。MRM实验原理如下图:



无需抗体:

通过设计母子离子对(Transitions)实现目标蛋白筛选,无交叉反应,避免假阳性结果。

方法建立长期性:

无需反复建立方法,每个蛋白transitions一次性建立,长期适用。

定量精确:

以合成肽段或者同位素标记作为内标,可得到每个蛋白的绝对定量值,精确至pg级。

高通量:

每run可检测多达20种蛋白。

重现性好:

多重保障(每个肽段多个transitions,每个蛋白多个肽段,每个信号多次检测),自动化操作,可在不同实验室间获得高重现性。

辨别蛋白亚型

依据蛋白亚型特异氨基酸序列设计transitions,区分不同亚型。

案例:心血管疾病潜在蛋白标志物的发现和鉴定

肥厚型心肌病心肌梗塞患者心肌损伤不同阶段生物标志物的发现和鉴定对于临床是非常重要的。本文中,作者开发了一套流程整合多种蛋白质组技术检测血浆中心肌损伤的早期生物标志物。来自心肌损伤之前、病中和之后的血液样本确保了潜在生物标志物的富集,各组患者互为生物对照。LC-MS/MS分析检测到121个高表达的蛋白质,包括之前已报道的心血管疾病生物标志物和超过100中新的候选生物标志物蛋白。通过MRM或免疫分析对来自外周血的分析物进行验证,结果表明这些候选生物标志物对心肌损伤高度特异。这篇文章表明,现代蛋白质组技术综合在一起,可以得到新的心血管生物标志物。


图注: 使用靶向性定量MRM-MS方法确认PMI患者外周血新的潜在生物标志物,检测6个蛋白在10,60和240分钟的变化。



 数据产出统计

 蛋白质鉴定结果

 蛋白质定量结果

 蛋白质GO分析

 蛋白质COG分析

 蛋白质Pathway代谢通路分析

 差异蛋白GO富集分析

 差异蛋白的Pathway富集分析

 重复性分析(仅针对有重复设计的项目)

 多样品间表达模式聚类(适用于样本数≥3的项目)



 1)富含杂质或蛋白含量低的样本,如植物的根茎、木质部、韧皮部组织等:干重≥5g

 2)植物类样本送样量同样适合于蕈类真菌,如蘑菇、木耳:湿重≥1g。

 3)细胞样本如需进行磷酸化位点富集鉴定,细胞数目须达到:107,约细胞沉淀体积100µl。

 4)由于解冻后血细胞易破裂,细胞内蛋白溶出来会影响分析结果,因此建议不要直接送全血样本。

 5)血液类样本:如果直接送提取蛋白,需先去除高丰度蛋白。

 6)尿液样本:送样前1000rpm离心5min,弃去沉淀。

 7)如果是其他特殊样本,或对样本要求有疑问,请联系我们。


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