表观遗传组学
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(m6A)RNA甲基化测序

近年来,科学家们首次发现了一种可逆的RNA甲基化—m6A,即RNA分子腺嘌呤第6位氮原子上发生甲基化修饰(N6-methyladenosinem6A)。研究发现,m6A是真核生物mRNA上最常见的一种转录后修饰, m6A在细胞加速mRNA代谢和翻译,以及在细胞分化、胚胎发育和压力应答等过程中起重要作用。种种研究迹象表明m6A 存在于很多物种中,占到了 RNA甲基化修饰的 80%m6A 除了分布在 mRNA 中,也出现在很多非编码 RNA中 ,如 : 环状RNA LncRNA等。Nature正刊发表文章,证实发生m6A RNA甲基化修饰可以调控mRNA稳定性。而随后Cell Research也发表文章,证实环状RNA也会被m6A 甲基化修饰,并会促进环状RNA编码蛋白这一有趣的结论。


图注:云序生物(m6A)RNA 甲基化测序流程


云序生物 m6ARNA甲基化测序产品



一站式服务
客户只需提供细胞、组织或RNA,云序生物为您完成从MeRIP富集,文库制备,上机测序到数据分析整套服务流程

优化的实验流程
MeRIP的富集效率是决定数据质量的关键,云序生物MeRIP实验采用预验证的商业化抗体和精心优化的实验流程,具有极高的效率和特异性

严格的质控
云序生物对MeRIP实验的各个关键步骤进行严格的质控,全程监控实验质量,确保客户得到优质的数据

专业的生物信息学分析
云序生物具有强大的生物信息学团队,能够满足客户的各类深入数据分析需求

特异性高
通过抗体特异性富集发生甲基化修饰的RNA片段,以较低的成本实现转录组范围的RNA甲基化研究。

案例1 Cancer cellm6A RNA去甲基化酶ALKBH5促进胶质瘤细胞

世界卫生组织将胶质瘤分为四级,其中恶性胶质瘤(GBM)属于最危险的第四级,手术治疗和化疗都难以避免其高复发率。近年来,m6A RNA修饰的研究已成为当今生命科学领域最前沿研究之一,不断有高分文章问世。m6A RNA修饰的催化、去除以及识别的分子机理研究越来越清晰,此时人们更关心m6A RNA修饰与重大疾病之间的相关性。近期Cancer CellIF: 27.406)报道了m6A RNA去甲基化酶ALKBH5在神经胶质瘤中具有生理作用。在本研究中,去甲基化酶ALKBH5在恶性胶质瘤干性样细胞表达上调,而ALKBH5高表达的胶质细胞瘤患者预后生存率更差。通过敲低ALKBH5meRIP鉴定m6A RNA甲基化修饰模式,基因芯片检测差异表达>2倍的基因,最终筛选到与细胞周期调控相关的FOXM1基因,其在GSCs的自我修复和肿瘤形成中起到关键作用。ALKBH5促使癌基因FOXM1转录本去甲基化,增加FOXM1表达。随后作者发现FOXM1反义长链非编码RNA——FOXM1-ASLOC100507424),与FOXM1 mRNA最后一个外显子有457个核苷酸互补。结果证实ALKBH5FOXM1-AS可与FOXM1协同作用,发挥促进恶性胶质瘤肿瘤形成作用。



1ALKBH5FOXM1-AS可与FOXM1协同作用,促进恶性胶质瘤肿瘤形成

案例2 Cell Reports环状RNA整体m6A修饰图谱

m6A RNA甲基化是RNA最常见的共价修饰方式之一,之前在线性的mRNAlncRNA中均有报道,包括一系列调控mRNA稳定性、促进mRNA翻译或降解等功能。环状RNA是近年来新发现的一类明星分子,Cell Reports IF=8.282)介绍发现环状RNA广泛存在m6A修饰,且呈现细胞特异性。并且,环状RNAm6A修饰酶和mRNA一致,而m6A修饰位点不同。本文也采取MeRIP-seq技术,进行环状RNA m6A甲基化修饰测序。作者比较了m6A抗体RIP实验后获得的样品和常规RNA样品中的差异情况,将m6A位点匹配到对应基因组区域。作者发现m6A修饰的环状RNA的来源外显子相对更大。所对应的外显子数目来看,m6A修饰的环状RNA来源的外显子数目以1-2个为主,并且随着形成环状RNA的外显子数目增多,它们的大小也逐渐减少。通过线性RNA m6A识别酶——YTHDF RIP实验作者发现,其同样作用于m6A修饰的环状RNA


2环状RNA m6A修饰图谱

原文

1 Zhang S, Zhao B S, Zhou A, et al. m6A Demethylase ALKBH5 Maintains Tumorigenicity of Glioblastoma Stem-like Cells by Sustaining FOXM1 Expression and Cell Proliferation Program. Cancer Cell, 2017

2 Genome-Wide Maps of m6A circRNAs Identify Widespread and Cell-Type-Specific Methylation Patterns that Are Distinct from mRNAs. Cell Reports, 2017



1、识别甲基化富集峰

通过高通量测序和生物信息分析,识别(p <1e-5)甲基化富集的基因组区域。


注:每个样品组做一个Input,以去除基因组背景,降低假阳性率

2、RNA甲基富集峰注释

通过生物信息分析利用最邻近基因对富集峰进行注释,并根据峰中点相对于已知基因的位置,将富集峰为启动子峰、上游峰、内含子峰、外显子峰、基因间峰。


3、RNA甲基化富集峰区域的在基因组中的分布

 根据注释信息,绘制富集峰在不同基因组特征上的比例图。


4、RNA甲基化位点Motif分析

RNA 上甲基化的位点,可能包含某种序列 motif RNA 甲基化酶可能正是通过识别这些 motif特异性进行甲基化修饰,从而完成转录后调控功能。我们成功识别了全基因组的 RNA 上的甲基化位点后,获取序列就能使用生物信息学的手段来搜索这些 motif,从而揭示 RNA甲基化修饰的机制。



5、差异RNA甲基化区域的识别与聚类

云序生物使用 MeTDiff 包进行差异甲基化位点的识别。默认筛选标准为 FDR<=0.05,具体以报告为准。 识别样本间的差异甲基化区,发现与特定表型或疾病相关的甲基化区域。


6、差异甲基化区的GO Gene Ontology与信号通路分析

对差异甲基化基因进行功能分类,并发现显著性富集的功能条目



7、Reads 的分布

使用 ngs.plot 工具可以展示匹配 reads 在 TSS,genebody,TES 等位点的分布情况,可以用来观察 RNA 甲基化对 TSS 等位点是否有偏好

 

    样品类型

     细胞、组织或基因组RNA,其他样本类型请电询。

    样品量

     a)细胞:2×108 

     b)组织:5g

     c)RNA300 μgOD260/2801.6-2.3RNA无明显降解(28S:18S>1.5RIN>7

    样品运输与保存

    样品运输:样品置于1.5mL Eppendorf管中,封口膜封好,干冰运输。

    样品保存:细胞样品或新鲜组织块可用TRIZOL或RNA保护剂处理,液氮冻存后-80℃保存;RNA样品可溶于乙醇或RNA-free的超纯水中,-80℃保存,避免反复冻融。



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