表观遗传组学
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RIP测序

RIP(RNA Immunoprecipitation)是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术,是了解转录后调控网络的有力工具。这种技术运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来,然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA进行分析。RIP-Seq将RIP技术与高通量测序相结合,能够高通量地检测与特定蛋白结合的RNA,从而解析全转录组范围内的目标蛋白-RNA相互作用网络。 


一站式服务:

客户只需提供细胞,组织或RIP RNA,云序生物为您完成从样品处理,文库制备,上机测序到数据分析整套服务流程。

商业化的RIP试剂盒:

RIP实验的成败是决定数据质量的关键,云序生物采用商业化RIP试剂盒,保证了RIP实验的成功率和稳定性。

严格的质控:

云序生物在实验的各个关键步骤加入了一系列质控点,全程监控实验质量,确保客户得到优质的数据。

专业化的生物信息分析:

云序生物具有强大的生物信息学团队,能够满足客户的各类深入数据分析要求


案例1解析RNA-蛋白相互作用

Genome-wide Identification of Polycomb-Associated RNAs by RIP-seq, Zhao et al. Mol Cell, 2010

Polycomb蛋白在干细胞分化和人类疾病中发挥着重要的作用。近期的研究表明:RNA分子可以作为共作用因子参与Polycomb抑制蛋白复合物2(PRC2)的形成。本文通过RIP测序在胚胎干细胞中找到了超过9000个与蛋白复合物PRC2相关结合的RNA分子。这些RNA中包括反义转录本,基因间转录本,基因启动子相关的转录本,以及很多未被注释的转录本。许多转录本来源于基因印迹区,癌基因或抑制基因位点或者是与干细胞相关的bivalent区域。这些结果说明:PRC2蛋白复合物广泛的与各类RNA结合,其中一些RNA可以作为人类疾病的分子标志物或是治疗靶点。

图1.  与PRC2蛋白复合物结合的RNA分类和统计


案例2识别miRNA靶基因

Genome-wide identification of translationally inhibitedand degraded miR-155 targets using RNA-interactingprotein-IP, Jan Meier, et al. RNA Biol. 2013

MiRNA可以通过降解靶mRNA或是抑制靶mRNA的翻译发挥调控作用。一个miRNA往往可以调控多个靶mRNA,因此在全基因组范围内系统性的研究miRNA的靶基因对准确解析miRNA的功能至关重要。仅通过miRNA表达谱和转录组分析并不能准确的确定miRNA靶基因。本文在过表达miR-155的HEK293T的细胞中,针对AGO2抗体进行了RIP测序,发现了100多个与AGO2蛋白结合的mRNA,其中有67个被预测为miR-155的靶mRNA。通过整合RIP测序和表达谱数据发现:这些靶mRNA有的通过mRNA降解被调控,有的则是通过翻译抑制被调控。


图2. 通过散点图展示:在过表达miR-155的细胞中与AGO2蛋白的结合相对于对照细胞来说显著性变化的mRNA


1、富集峰识别与注释

在RIP-Seq中,富集峰代表了所有活跃转录的区域(相对于对照IgG)。利用富集峰的注释绘制富集峰在不同基因组特征上的比例图。从总体上查看峰偏向的基因组特征


2、差异富集区鉴定和注释

云序生物使用diffReps软件进行差异富集区(differentially enriched peaks,DEPs)鉴定。默认p-value<0.0001,fold change >=2.0作为差异阈值。(具体以报告为准)


3、富集峰差异富集区相关基因go分析

云序生物利用启动子区(TSS-2000 ~ TSS+2000)差异富集峰对应的基因进行GO功能分析,以注释并推测这些富集峰(蛋白质)可能参与的功能。 P-value <= 0.05的GO terms被认为是统计显著的

4、富集峰/差异富集区相关基因KEGG通路分析

KEGG PATHWAY是将基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学中的分子数据集映射到KEGG通路图上,以进行这些分子的生物学功能解释的过程。云序生物利用启动子区(TSS-2000 ~ TSS+2000)富集峰对应的基因进行通路分析,以注释并推测这些富集峰(蛋白质)可能参与的通路。以P-value <= 0.05作为显著富集的阈值


5、富集峰可视化

MACS产生了UCSC wig格式的可视化文件。该文件可以上传到UCSC Genome Browser以在基因组环境中直观地展示富集峰。云序生物使用50 bp分辨率进行富集峰可视化以供参考

样品类型:

细胞、组织或IP后的RNA。其它类型样品请详询。

样品量:

a)细胞 5×108

b)组织100 mg

c)IP后的RNA >1μg,OD260/280≥1.8;OD260/230≥1.5(无明显降解,电泳检测样品特征性条带完整清晰,无明显弥散或拖尾 )

样品运输及保存

样品运输样品置于1.5mL Eppendorf管中,封口膜封好,干冰运输。

样品保存细胞样品或新鲜组织块可用TRIZOL或RNA保护剂处理,液氮冻存后-80℃保存;RNA样品可溶于乙醇或RNA-free的超纯水中,-80℃保存,避免反复冻融。


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